三峡库区丹参中砷暴露对小鼠的肝肾毒性损伤研究*

刘 佳 ，黄海兵 ，余 蕾

（1.重庆三峡中心医院，重庆 404120； 2.重庆三峡医药高等专科学校，重庆 404120）

丹参 Salvia miltiorriza Bunge.为常用的活血化瘀药，药用其根及根茎，性味苦、微寒，归心、肝经，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效［1］。但由于受生长环境及地域等影响，易致丹参药材中重金属有害元素，如砷（As）、镉（Cd）、铅（Pb）、汞（Hg）等含量超标［2-3］。前期研究发现，三峡库区丹参中砷含量超标。砷是全球重要的环境污染物之一，可致机体多器官损伤甚至癌症［4-5］。杨瑞瑛等［6］用亚砷酸钠诱导出大鼠亚急性砷中毒模型，显示中毒组大鼠各脏器组织中砷的含量均极显著高于正常对照组（P＜0.01）。本试验中选用三峡库区产丹参，用丹参提取物给小鼠灌胃给药，观察砷的代谢靶器官肝、肾病理学变化，并测定砷敏感毒性基因的表达，为丹参中砷元素的质量控制和毒理学研究提供参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试药与仪器

动物：昆明种小鼠，清洁级，雄性，体重18～22 g，合格证号0002438，购自第三军医大学大坪医院实验动物中心。饲养环境SPF级，室温20～25℃，相对湿度40% ～70%，每日光照12 h，每笼5只，自由摄食、饮水。

试药：丹参采集于重庆万州区后山镇，经重庆三峡医药高等专科学校药学系李晶博士鉴定为正品。雄黄（北京同仁堂有限公司，国药准字Z11020959）；RNA提取纯化试剂盒（南京建成生物研究所，货号为E058）；逆转试剂盒、Trizol（宝生物工程＜大连＞有限公司，货号分别为 DRR014A，9109）；SYBR Green PCR Master Mix（英国 ABI公司，货号为 4367659）；金属硫蛋白 -1（MT-1）引物（上海吉凯基因化学技术有限公司合成，上游序列AATGTGCCCAGGGCTGTGT，下游序列 GCTGGGTTGGTCCGATACTATT）；其他试剂均为分析纯。

仪器：Olympus 7060型全自动血生化分析仪（日本）；AFS-2100型全自动双道原子荧光光谱仪（北京科创海光仪器有限公司）；PTC-225 型 real time RT-PCR 仪（BIO-RAD，美国）；TU-180型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Labstar 96孔多功能梯度 PCR仪 （德国）；电子天平（200S，Sanyo Company，日本）；Millipore SAS 67120 型超纯水仪（Millipore Inc，美国）。

1.2 方法

动物分组与给药：取小鼠35只，随机分为正常对照组，丹参低、中、高剂量组（20，40，80 mg ／kg）和雄黄组（80 mg ／kg）。丹参提取物系经水提、大孔吸附树脂纯化所得，纯化后丹参提取物以丹参总酚酸为标准（含量79.3%），每1 g含生药15.46 g。正常对照组未做任何处理，其他4组连续灌胃给药7 d，每天1次。

血清肝肾功能指标测定：第8天断头处死小鼠后取血，以全自动生化分析仪测定血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）的含量。

组织中砷含量检测：各取肝、肾组织约50 mg，分别放入消化罐中，加酸，烤箱175℃消化3.0 h，自然冷却后转入试管，超纯水定容，混匀，即得样品消化液。取消化液样品5 mL，加入1 mL 5%硫脲-抗坏血酸溶液混合，静置5 min后，以原子荧光光谱仪测定样品中砷含量。

病理学观察：取适量肝脏中叶和肾组织（含皮、髓质），4%甲醛固定、石蜡包埋、切片，HE染色，观察各组肝脏和肾组织病理学变化。

MT-1 mRNA表达检测：取各组小鼠肝、肾组织各50 mg，加入Trizol 1 mL，匀浆（冰上操作），萃取沉淀，RNA柱纯化。以紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。按RNA抽提试剂盒操作提取总RNA，逆转录酶催化合成cDNA，以此为模板低温下加样PCR扩增。反应体系包括 cDNA 3 μL，引物 0.5 mL，SYBR Buffer溶液8 μL，去RNA酶水4 μL和内参。加入96孔板后PCR仪检测肝、肾组织中MT-1 mRNA的表达。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清肝肾功能指标

结果见表1。可见，与正常对照组比较，血清中ALT，AST，BUN和Cr水平雄黄组均显著升高（P＜0.05），而丹参各剂量组虽有所变化，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表?1 5组小鼠肝肾功能指标变化比较（ ± s，n＝7）

表?1 5组小鼠肝肾功能指标变化比较（ ± s，n＝7）

注：与正常对照组比较，*P ＜0.05。

组别正常对照组丹参低剂量组丹参中剂量组丹参高剂量组雄黄组ALT（U ／L）51.2 ± 1.67 52.2 ± 1.54 52.6 ± 1.72 53.1 ± 2.07 64.3 ± 1.86*AST（U ／L）254 ± 3.12 257 ± 1.74 260 ± 1.85 263 ± 2.49 283 ± 2.45*BUN（mmol／L）12.2 ± 1.32 13.0 ± 1.56 12.9 ± 1.94 13.2 ± 1.69 16.9 ± 2.16*Cr（μmol／L）10.2 ± 2.56 10.6 ± 2.19 11.1 ± 1.87 11.4 ± 1.75 15.6 ± 2.55*

2.2 肝、肾组织病理学变化

病理解剖：5组大鼠肝脏、肾脏解剖无大体病变。肝软色红，边缘清晰，表面无出血、黄色等显著病理变化。肾被膜完整，肾实质表面光滑，无出血、淤血等明显病变。

大鼠肝脏HE染色组织学病变观察：正常对照组肝小叶间隔整齐，呈多面棱柱状，结构完整，以中央静脉为中心肝细胞向四周呈放射状排列，无变形和炎性浸润或纤维组织增生；雄黄组肝细胞体积增大，镜下见部分肝细胞明显水肿；与正常对照组比较，丹参各剂量组均无明显变化（见图1 A）。

肾脏HE染色组织学病变观察：正常对照组和丹参各剂量组均无明显改变，而雄黄组肾小管上皮细胞明显水肿，间质出现炎性浸润，肾小球膜增厚，内皮细胞在管腔内形成细胞管型，血管无明显扩张（见图1 B）。

2.3 肝、肾组织MT-1 mRNA表达

正常对照组及丹参各剂量组MT-1 mRNA表达量无明显变化，而雄黄组表达量显著升高。

2.4 肝、肾组织砷蓄积量检测

结果见表2。可见，与正常对照组相比，仅丹参高剂量组小鼠肝脏中检测到微量砷，而肾脏未检出。雄黄组肝、肾组织均检测到砷蓄积。

3 讨论

丹参因其毒副作用小、疗效好而深受青睐，但由于在栽培、加工、贮存等过程中，不同程度地受到有毒有害物质的污染而影响了其安全性［6-7］。中药中重金属含量超标是一个非常突出的问题［8-9］。据不完全统计，常用的300多种中药材中，很多生药所含As，Pb，Hg，Cd等重金属大大超过了美国食品药物管理局（FDA）规定的指标，有的则是农药残留超标或含FDA认定的毒性成分［10-11］。三峡库区所产丹参主要为砷含量超标，其余重金属如镉、汞等含量均未超标。

图1 大鼠肝、肾组织病理学变化（×200）

表2 各组肝、肾组织砷蓄积检测结果（ ± s，n ＝7，ng／g）

表2 各组肝、肾组织砷蓄积检测结果（ ± s，n ＝7，ng／g）

注：ND表示未检测到。

组别正常对照组丹参低剂量组丹参中剂量组丹参高剂量组雄黄组肝脏砷含量ND ND ND 0.09 ± 0.02 136.58 ± 4.88肾脏砷含量ND ND ND ND 80.95 ± 3.61

肝脏是砷毒性作用的主要靶器官，近年来动物试验和人群流行病学调查均表明砷可引起不同程度的肝损害，ALT和AST是反映肝细胞炎性损伤的重要指标［8］。肾脏是砷及其代谢物排泄的主要器官，也是砷主要的蓄积部位和毒性靶器官之一。BUN和Cr主要通过肾脏排泄，为评价肾功能的重要指标。本试验中的丹参用量远远高于中成药中丹参含量，连续灌胃给药1周后小鼠血清中ALT、AST、BUN和Cr水平与正常对照组相比，差异无统计学意义，说明丹参大量给药对小鼠肝、肾功能几乎无影响。

砷的毒理作用机制可能和激发活性氧自由基导致的氧化性损伤有关。MT-1存在于哺乳动物体内多器官的细胞质，可与砷结合为配合物，解除其毒性，保护肝、肾等脏器。与正常对照组比较，丹参各剂量给药组小鼠肾组织中均未检测到砷，也未见MT-1 mRNA表达量显著升高。

砷的毒理学研究证明，肝、肾损伤程度和砷蓄积量呈正相关。雄黄组小鼠的体内肝、肾组织检测到一定量的砷蓄积，仅丹参高剂量组肝脏检测出微量砷，而低、中剂量组肝组织及丹参各剂量组肾脏中均未检测到砷蓄积。

综上所述，丹参中所含坤的毒性远远小于雄黄的毒性，常规剂量给药是安全的。

参考文献：

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