海南粗榧内生真菌对罗非鱼无乳链球菌抑菌活性研究

阳辉蓉 刘四新 李武 吴延春 胡文婷 刘翊昊 胡晓苹 李从发

摘  要  利用活菌菌饼法和滤纸片法研究筛选64株海南粗榧内生真菌对罗非鱼源无乳链球菌的抑菌活性，并对活性菌株的代谢产物化学成分进行初步测试。菌饼试验结果显示，11株海南粗榧内生真菌对无乳链球菌具有明显抑制作用，占总菌株数的17.2%，抑菌圈在Φ（8.7±0.3～16.2±0.2）mm间。滤纸片试验结果显示，12株具有明显抑制作用，占总菌数的18.8%，抑菌圈在Φ（8.7±0.3～28.2±0.4）mm间。2种方法的最高活性菌株不一致，但最高活性菌株（B30、F52）和同时显示较高活性的菌株（B14、B30、B32、F7、F52）被测出都含有甾体及三萜类化合物。根据结果推测，对无乳链球菌有显著抑制作用的菌株可能含有甾体及三萜类物质。结果为深入研究内生真菌对罗非鱼无乳链球菌的抑制奠定基础，也为生物防治罗非鱼病害提供有益借鉴。

关键词  海南粗榧;内生真菌;罗非鱼;无乳链球菌;抑菌活性;甾体及三萜类

中图分类号  R284          文献标识码  A

Antimicrobial Activity of Endophytic Fungi from

Cephalotaxus hainanensis Li to Streptococcus

agalactiae Isolated from Tilapia

YANG Huirong1， LIU Sixin1， LI Wu1， WU Yanchun1， HU Wenting2，

LIU Yihao1， HU Xiaoping1， LI Congfa1 *

1 College of Food， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 College of Marine， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract  Fungal cake and filter paper methods were used to determine the antimicrobial activity of 64 endophytic fungi from C. hainanensis Li to S. agalactiae isolated from tilapia， and the chemical composition of the active strains was also detected. The results showed that： by the fungal cake method， eleven of 64 strains had significant inhibiting effect on S. agalactiae， 17.2% of the total number of strains， and the inhibition zone diameter ranged from（8.7±0.3）mm to（16.2±0.2）mm. By the filter paper method， there were 12 strains showing significant inhibiting effect on S. agalactiae， which accounting for 18.8% of the total number of the strains. The inhibition zone diameter ranged from（8.7±0.3）mm to（28.2±0.4）mm. The highest activity strain tested by the fungal cake method was not the same with that of the filter paper method.  However， the strains of the highest activity（B30 and F52）and the strains of higher activity（B14， B30， B32， F7）， which obtained by fungal cake and filter paper methods， were inclusive of steroids and triterpenoids. This paper laid the foundation for further research on the endophytic fungal inhibity activity on S. agalactiae， and also provided a useful reference to the biological control of tilapia disease.

Key words  Cephalotaxus hainanensis Li; Endophytic fungi; Tilapia; Streptococcus agalactiae; Antimicrobial activity; Steroids and triterpenoids

doi  10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.022

中国罗非鱼（Tilapia）的生产和出口均为世界第一，是中国最具国际竞争力的淡水养殖品种，也是中国南方水产养殖的支柱性产业[1]。然而，由无乳链球菌（Streptococcus agalactia）、海豚链球菌（S. iniae）等引起的罗非鱼病害，已成为目前罗非鱼养殖业发展的重大阻碍，每年给全世界包括中国造成巨大的经济损失[2]。无乳链球菌也被称作B群链球菌[3]，还是引起奶牛乳房炎的病因之一，同时也是免疫抑制人群、孕妇、新生儿等的重要病原菌[4]。可见，链球菌病不仅对渔业和畜牧业产生巨大危害，而且对食品安全和人类健康也构成严重威胁[5]。

当前，在罗非鱼养殖中通常使用抗生素、化学药物等对链球菌病进行防治，但是存在较严重的停药反弹现象，且存在病原菌耐药性增强和鱼体药物残留等明显缺陷[6]，对人类健康产生安全隐患，同时也对生态环境造成不良影响。目前尚未找到对罗非鱼链球菌病高效且安全的防治措施[7]，因此，对罗非鱼链球菌病及对这些病原菌的相关研究尤为重要。近年来，研究者们热衷于以中草药对无乳链球菌、海豚链球菌的抗菌研究。吴颖瑞等[1]研究了153种中草药对罗非鱼无乳链球菌和海豚链球菌的抑制活性。李一珊等[8]研究了黄连和五倍子的乙醇提取物对罗非鱼源性链球菌生长曲线的影响。也有利用水产益生菌等开展的抑菌研究。植物内生真菌在活性物质种类和产量方面表现出巨大潜力，其合成的次生代谢产物不但化学成分丰富，而且具有多种多样的生物活性，如抗肿瘤活性、抗病原微生物活性、抗病毒活性、酶抑制活性、免疫抑制活性和杀虫活性等[9]，其中一些内生真菌由于能产生与宿主相同或相似的次生代谢产物[10]而研究热度与日俱增，从中发现新化合物的报道也屡见不鲜[11]。海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis Li）及其内生真菌是本实验室长期开展研究的方向之一，海南粗榧的多种组织中都能产生多种生物碱，其中三尖杉酯碱和高三尖杉酯碱已被开发成抗白血病药物[12]。本实验室前期研究结果表明，分离自海南粗榧树皮的内生真菌也能产生种类丰富的生物活性物质[13]。中国南方地区的罗非鱼病多由无乳链球菌所致[14]，而目前尚未见关于内生真菌代谢产物对罗非鱼病抑菌作用的相关研究报道。因此，本试验以筛自海南省热带植物园、海南尖峰岭和霸王岭自然保护区的64株海南粗榧内生真菌为研究对象，研究其对罗非鱼源无乳链球菌的体外抑制活性，为寻找内生真菌来源的无乳链球菌抑制剂的深入研究奠定前期基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  海南粗榧内生真菌   64株内生真菌筛选自海南省热带植物园、海南尖峰岭自然保护区、霸王岭自然保护区三地的海南粗榧（Cephalotaxus hainanensis Li）树皮、树叶等组织，均保藏于本实验室。

1.1.2  供试菌株   罗非鱼源无乳链球菌（Streptococcus agalactiae HYXY08），分离自罗非鱼病鱼，保存于本实验室。

1.1.3  培养基   PDA培养基、PDB培养基、脑心浸液培养液（BHIB）、脑心浸液琼脂培养基（BHIA）参照文献配制[13]。

1.2  方法

1.2.1  菌饼法抑菌活性测试   将保藏的内生真菌在新鲜的PDA斜面上活化培养3～5 d，然后接种于PDA平板上，于28 ℃培养11 d后用于菌饼法活性测试。

将保藏的无乳链球菌HYXY08在新鲜的BHIA斜面上培养24 h，用BHIB洗下菌苔，充分涡旋摇匀，采用显微计数法，将其稀释为106 cfu/mL的菌悬液。取1 mL菌悬液混菌法制备无乳链球菌的检测平板。

用Φ6 mm的灭菌打孔器制备每种内生真菌的菌饼若干片，无菌接种于无乳链球菌的检测平板上，每株内生真菌设3个重复，以未接种的PDA琼脂饼片作阴性对照（CK-1）置于平板中央。28 ℃培养24 h后测定抑菌圈直径，取平均值[15]。

1.2.2  滤纸片法抑菌活性测试   将每株内生真菌的斜面活化种子接种至300 mL PDB培养基中（1 L锥形瓶），每菌株3瓶平行，并设未接种的空白培养基作阴性对照（CK-2）。28 ℃，160 r/min振荡培养11 d ，滤纸抽滤得到发酵上清液，以发酵液：乙酸乙酯=1 ∶ 1（V/V）超声萃取，循环3次，减压旋蒸、浓缩后得到代谢产物粗提物，4 ℃冷藏备用。

以丙酮溶解上述代谢产物粗提物、配成10 mg/mL的丙酮溶液，将其加到Φ6 mm的灭菌滤纸片上，每片加20 uL，风干后摆放于无乳链球菌的检测平板上，每样品设3个重复。以纯丙酮溶剂吸附的滤纸片做阴性对照置于平板中央。28 ℃培养24 h后测定抑菌圈直径，取平均值[16]。

1.2.3  活性菌株代谢物初步测试   根据待测样品与所加指示试剂发生的沉淀或颜色反应特征，初步推测其化学成分的种类。在试管中通过沉淀和颜色反应测试生物碱、甾体及三萜类化合物、蒽醌及其苷类、黄酮及其苷类和皂甙类化合物;在滤纸片上进行颜色反应测试酚类和有机酸化合物[17]。

1.3  数据处理

采用Microsoft Excel 对所得数据进行统计分析，结果以平均值±标准差（±SD）表示。

2  结果与分析

2.1  菌饼法抑菌活性测试

以菌饼法测试64株海南粗榧内生真菌对罗非鱼无乳链球菌的抑菌活性（表1），结果表明，有明显抑制作用的有11株，占总菌株的17.2%。抑菌效果最好的是分离自海南省热带植物园的B30菌株，抑菌圈为Φ（16.2±0.2）mm;抑菌效果相对较好的有F45、A13、B14、B6等菌株，样品来自海南省热带植物园（代号A和B）、海南尖峰岭自然保护区（代号C、D、E）和霸王岭自然保护区（代号F）。

2.2  滤纸片法抑菌活性测试

滤纸片法的测定结果（表2）表明，64株内生真菌代谢产物乙酸乙酯粗提物中有12株对罗非鱼无乳链球菌具有明显抑制作用，占总数的18.8%。抑菌效果最好的是分离自霸王岭自然保护区的F52菌株，抑菌圈为Φ（28.2±0.4）mm，相对较好的有B32、A21、B14、B30、D4、F7、F103、F39等菌株。其中2种方法都显示抑菌较好的是B14、B30、B32、F7和F52等菌株。

2.3  活性菌株代谢产物的初步测试

对12株活性菌的代谢产物逐一进行化学成分的初步测试，根据反应现象（沉淀、颜色等）预测其所含化合物的种类，结果（表3）表明，含有甾体及三萜类和生物碱类代谢产物的菌株较为丰富，分别有8株和6株;含有皂苷类的菌株有5株;含酚类和蒽醌及其苷类的均为4株;含黄酮及其苷类和有机酸较少，分别只有3株和2株。其中D4只显示含皂苷类化合物，F39只显示含生物碱，而A21显示含有4类化合物，F127显示含有6类化合物，这说明海南粗榧内生真菌的次级代谢产物种类多样。其中菌饼法高活性菌株B30含有甾体及三萜类、酚类和生物碱类化合物;滤纸片法高活性菌株F52含有甾体及三萜类、蒽醌及其苷类和皂苷类物质，显示2菌共有的成分是甾体及三萜类化合物，而2种方法均显示较高活性的菌株B14、B30、B32和F7、F52中，都测试到含有甾体及三萜类。

3  讨论与结论

当今，内生真菌产生的生物活性物质是一个研究的热点。人们从内生真菌中分离到很多活性物质，如Zheng等[18]从人参的内生真菌分离出2个新化合物和6个已知化合物，其中化合物brefeldin A对MKN45、LoVo、A549、MDA-MB-435、HepG2和HL-60等6株癌细胞表现出极强的细胞毒性，其IC50<0.12 μg/mL，化合物ginsenocin和penicillic acid对这6株癌细胞也表现出很强的细胞毒活性，其IC50在0.49～7.46 μg/mL之间。Ferdinand等[19]从可可树的一株内生真菌分离出3种新的聚酮类化合物，它们对腐霉、丝囊霉和纹枯病有极强的抑制作用。Hidayat等[20]从内生真菌中分离出3个已知化合物和3个新化合物，其中colletonoic acid表现出很好的抑制细菌、真菌和藻类的活性。本实验室长期开展的海南粗榧内生真菌研究显示其抑菌、抗癌活性高，次级代谢产物种类丰富，而对病原菌的抑菌作用机制尚不够清楚，通常起作用的产物成分之间可能存在协同机制。本研究结果显示：菌饼法和滤纸片法分别有11株和12株对无乳链球菌具有明显抑制作用;这些内生真菌对罗非鱼无乳链球菌的抑菌代谢产物种类比较丰富多样，但对无乳链球菌有显著拮抗作用的菌株都含有甾体及三萜类化合物。而本研究所用菌饼法和滤纸片法所测得的最高活性菌株以及抑菌的作用不一致。这种现象可能的原因有：（1）2种方法培菌方法不同，内生菌所能合成的次级代谢产物种类和浓度可能不同;（2）2种方法所能测试的抑菌物质浓度不同，纸片法是乙酸乙酯提取、浓缩后所测，其抑菌圈显然也大，因此推测菌饼法中的高活性菌株（如B30、F45、B14等）可能具有较强的抑菌物质合成能力，且能分泌到胞外。

本研究结果将为深入研究内生真菌对罗非鱼无乳链球菌的拮抗作用奠定了基础，也为生物防治罗非鱼无乳链球菌病提供有益借鉴。

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