建兰与寒兰杂交后代试管花诱导及其形成过程的形态学及细胞学观察

陈达菊 曾瑞珍 杨青 朱汉勇 陈显梅 梁计南 张志胜

摘  要  从建兰与寒兰杂交后代的根状茎、试管苗和根状茎薄层均诱导出试管花，诱导率分别为61.67%、80.00%和16.67%。对根状茎、试管苗和根状茎薄层试管花形成过程的形态学观察结果显示，试管花的形成和发育过程可分为花芽诱导期，花芽形态建成期，开花期，谢花期4个时期。以试管苗为材料的试管花形态建成所需的时间最短，根状茎次之，根状茎薄层所需的时间最长。细胞学观察结果显示，根状茎试管花起源于皮层，其形态建成过程可分为花序原基形成期、花序原基分化期、小花原基形成期和小花原基分化期4个时期。

关键词  兰花;试管花;试管苗;根状茎;薄层;细胞学观察

中图分类号  S682.31          文献标识码  A

Morphological and Cytological Observation on Formation of

Hybrid Offspring of Cymbidium ensifolium and

C. karan Test-tube Flower

CHEN Daju1， 2， ZENG Ruizhen2， YANG Qing1， ZHU Hanyong1，

CHEN Xianmei1， LIANG Jinan2， ZHANG Zhisheng2 *

1 Institute of Biotechnology， Wenshan Academy of Agricultural Sciences， Wenshan， Yunnan 663000， China

2 Guangdong Provincial Key Laboratory of Plant Molecular Breeding， South China Agricultural University，

Guangzhou， Guangdong 510642， China

Abstract  Test-tube flowers were induced from rhizomes， plantlets and thin-cell layers of rhizomes of hybrid offspring of Cymbidium ensifolium and C. karan， the induction rates were 61.67%， 80.00% and 16.67%.. Forming process of in vitro flowering of rhizomes， plantlets and thin-cell layers of rhizomes were observed and the process could be divided into 4 stages： flower-bud induction， flower-bud development， flowering period， and inflorescences shed. The morphogenesis time of test-tube flower was the shortest by using of plantlets in vitro as materials， following by rhizomes， and the longest appeared in using thin-cell layers of rhizomes as material. Test-tube flower of rhizomes originated from cortex， and its formation and development could be divided into 4 stages： formation of inflorescence primordium， differentiation of inflorescence primordium， formation of floret primordium， differentiation of floret primordium.

Key words  Orchid; Test-tube flower; Test-tube seedling; Rhizome; Thin-cell layers; Cytological observation

doi  10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.019

中国兰花通常是指兰属（Cymbidium）兰花中的一部分地生种，如春兰、蕙兰、建兰、墨兰和寒兰等[1]。在温室栽培条件下，这些兰花从种子播种到开花至少需要5 a时间。因此研究这类兰花提早开花的技术，对缩短育种周期，推动中国兰花育种和产业发展具有重要的现实意义。

植物在离体培养过程中会发生开花现象，但通常频率很低。本文将植物的器官、组织、细胞、中间繁殖体和试管苗等在离体培养条件下形成的花定义为试管花（test-tube flower）。1981年，王熊等[2]以建兰[C. ensifolium（L.）SW.）]和[（C. ensifolium cv. ‘Qiulan）]为试验材料，建立了快速无性繁殖系，并发现试管幼苗开花现象。1984年，王熊[3]报道秋兰试管苗一年四季都有花蕾形成，从植株形成到花朵开放最短只需2个月。1988年又报道成功诱导素心建兰的试管开花[4]。Zhang等[5]研究结果表明，3.3～10 μmol/L TDZ或10～33 μmol/L 2iP与1.5 μmol/L NAA结合能诱导建兰的根状茎形成早熟花，这些花形态正常，开花时间持续2周。郑立明等[6]将春兰×大花蕙兰的一个株系的原球茎及幼苗接种在附加BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L的1/2 MS培养基上，2个月后形成肉眼可见的花蕾，1～2 cm幼苗的花芽形成率达19%。近年来，虽然许多学者对试管花做了很多研究，但目前对试管花形成和发育过程缺乏系统的研究，同时也未见到以根状茎薄层诱导试管花的研究报道。

本研究以建兰（小桃红）×寒兰的杂种根状茎、根状茎薄层和试管苗为材料，研究兰花试管花诱导技术及其形成和发育过程，为建立高效试管花诱导技术体系，加速国兰新品种选育和开展成花机理研究奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

将小桃红×寒兰的杂交种子接种到种子萌发培养基上诱导出根状茎，继代繁殖一定的数量后，将其中一部分进行苗分化，另一部分继续进行继代增殖。将继代培养的根状茎切成1 cm和1 mm薄层。以3 cm左右高的试管苗、1 cm根状茎和1 mm根状茎薄层为试验材料进行试管花诱导。

1.2  方法

1.2.1  试管花的诱导   由于薄层在诱导过程中容易坏死，根状茎容易分化而生根试管苗分化较难，因此采用了不同培养基。将根状茎接种到MS1+6-BA 10 mg/L+蔗糖5%+1.2%卡拉粉，根状茎薄层接种到MS+TDZ 0.05 mg/L+6-BA 4 mg/L+5%Su+1.4%卡拉粉，试管苗接种到MS2+6-BA 8 mg/L+TDZ 0.05 mg/L+6% Su+1.2%卡拉粉培养基上于16～26 ℃，8 h光照，光照强度3～5 μmol/（m2·s）下培养。每天观察和记录材料的形态学变化，并在解剖镜下拍照直到材料开花。

MS1：1/12N，15P，MS基本培养基其他成分不变，硝酸钾增加，磷酸二氢钾中磷增加到15倍，不含硝酸铵;MS12：1/4N，30P，NH4-N/NO3-N：1 ∶ 5，MS基本培养基其他成分不变，磷酸二氢钾中的磷增加到30倍。

1.2.2  试管花形成和发育过程的细胞学观察   采用PEG包埋切片法[7]。

2  结果与分析

2.1  试管花的诱导

将根状茎、根状茎薄层和试管苗接种诱导培养基上进行试管花的诱导（表1）。研究结果表明，根状茎、根状茎薄层和试管苗均能诱导形成试管花，且诱导所需要的温度和光照条件一致，适宜的温度和光照条件均为温度16～25 ℃变温，光照度3～5 μmol/（m2·s）和每日8 h光照。但不同起始材料的最适诱导培养基和在该培养基的诱导率不同。根状茎试管花的适宜诱导培养基为MS1+6-BA 10 mg/L+5% Su，诱导率为61.67%，根状茎薄层试管花的适宜诱导培养为MS+TDZ 0.05 mg/L+6-BA 4 mg/L+4% Su，诱导率为16.67%，试管苗试管花的适宜诱导培养为MS12+6-BA 8 mg/L+TDZ 0.05 mg/L+6% Su，诱导率为80.00%，正常开花率为26.67%。

2.2  试管花形成过程的形态学观察

2.2.1  根状茎试管花的形成过程   小桃红×寒兰根状茎材料较细，深绿色（图1-A），接入花芽诱导培养基上培养15 d后，部分根状茎周围开始出现白色突起（图1-B），30 d左右芽长约0.5 cm，乳白色、芽尖红色，每条根状茎分化出1～2个芽（图1-C），若芽呈乳白色，芽尖红褐色，芽体晶莹剔透，则可能是花芽。如果此时条件不适宜花芽发育，芽尖就坏死，无法分化形成花蕾或畸变。

培养50 d到60 d后花芽伸长，长出3-4个鞘包被着花序（图1-D），这时可以确定分化出来的芽是花芽。培养90 d左右，苞片形成，小花可见，有些花序只有一朵花，而有些则有多朵花（图1-E）。随后小花继续发育，100～120 d小花陆续开放（图1-F，图1-G），部分小花需要培养150 d或者更长的时间才开放（图1-H），开花10 d左右颜色变淡，花干枯并开始凋谢。

2.2.2  试管苗试管花的形成过程   将小桃红×寒兰的试管苗接入花芽诱导培养基上培养（图2-A），30 d左右，茎尖分生组织由营养生长转向生殖生长，形成浅绿色或白色的鞘和花芽;40 d左右分化出苞片和小花（图2-B）;随后花序继续伸长，花蕾继续发育，50～60 d花蕾清楚可见，并开始向一侧弯曲（图2-C）;80 d左右小花开放（图2-D）。但大部分茎尖形成的花芽瘦弱且无法发育成为正常花或者无法开花。

随着茎尖分生组织分化花芽的进行，试管苗基部也开始膨大，形成假鳞茎（图2-F）。当茎端的花芽发育到一定程度，假鳞茎上的腋芽开始分化形成花芽（图2-E），当茎尖分化出的花芽坏死或花凋谢之后，侧花芽迅速发育（图2-F，2-G），培养100 d左右小花开放（图2-H），大部分侧花芽比茎尖花芽壮，能正常开花。培养至110 d左右，花凋谢（图2-I）。试管花也可以从基部膨大而茎尖未分化花芽的试管苗的叶腋直接分化形成，每个叶腋都有可能分化出花芽，甚至从花序的鞘也能分化出花芽。但如果植株营养供应不足或条件不适宜时，花芽不能正常发育和开花。

2.2.3  根状茎薄层试管花的形成过程   将根状茎切成薄层后接入培养基中培养（图3-A），30 d左右，50%以上的根状茎薄层死亡（图3-B），存活的多为根状茎顶端的薄层，其中大部分都能分化出锥形芽（图3-B）;40 d后花芽开始伸长，芽尖浅褐色，弯曲（图3-C）;80 d左右鞘分化形成，小花也开始分化形成（图3-D）;90 d左右花序进一步伸长（图3-E），120 d左右，花序伸到最长，小花之间分开，含苞待放（图3-F）。150 d左右开放（图3-G，3-H），然后凋谢或坏死（图3-I）。

2.3  根状茎试管花形成过程的细胞学观察

根状茎是由单层细胞的表皮、皮层和中柱组成（图4-A）。将根状茎接入诱导培养基中10～15 d，皮层细胞开始分裂形成突起（图4-B），随后表皮细胞和皮层细胞分离，在突起的下方分化产生维管束组织，从而形成“T”结构（图4-C）。此时为花序原基形成期。

随着培养的进行，试管花分化进入花序原基分化期（图4-D），此时鞘逐渐分化形成，生殖生长锥呈半球形，光滑，一直包在鞘中（图4-E），培养60 d左右，鞘分化完成（图4-F）。

苞叶原基的出现标志着试管花分化进入小花原基形成期，苞片原基的分化是从生长锥基部开始的，由于两个苞片原基同时形成，他们和生长锥一起形成品字结构（图4-F），随着苞片的形成（图4-G），生长锥逐渐变尖，上面出现突起，接着在苞片内侧形成小花原基（图4-H）。随后小花原基不断伸长，中部出现突起，形成小花的基本形状结构（图4-I），培养后80 d，小花分化结束。

根状茎试管花形成过程的分期及其各期特征见表2。

3  讨论与结论

兰花离体开花的研究国内外已经有大量的报道[2-6，8-43]。兰科中包括兰属中的部分种及杂交后代（建兰[2，4]、寒兰[16-17]、春兰×大花蕙兰[6]、春剑×大花蕙兰[41]Cymbidium niveo-marginatum Mak.[8]），石斛兰属中的部分种或品种（如春石斛[18-21]、铁皮石斛[19，22]、细茎石斛[23]、金钗石斛[24]、霍山石斛[25]、叠鞘石斛[26]、报春石斛[27]、Dendrobium Madame Thong-In[28-29]、Dendrobium Sonia17[30]、Dendrobium Chao Praya Smile[31]、Friederick's Dendrobium[32]等），文心兰属[9]（Psygmorchis pusilla[33-34]），蝴蝶兰属[14] （Doritaenopsis and Phalaenopsis[32，38]），大花蕙兰[6]，石豆兰属[37]，虎蛇兰属[39]，美冠兰属[42]，地宝兰属[43]， 五唇兰属（Doritis pulcherrima）与尖囊兰属Kingiella philippinensis[13]等几个属及其属间杂交种已经获得了试管花。本研究结果表明，建兰与寒兰杂交后代的根状茎、试管苗和根状薄层也可以成功诱导形成试管花。

研究兰花试管开花能大大缩短兰花在试管外从苗期到成熟开花期的时间[36]，满足育种者提早对花部性状选择的需求。要通过诱导试管花来加速育种进程或者把试验结果商品化，就需要诱导出正常的花，但目前有关正常开花率的研究还较少[23]，并且大部分兰花的试管花诱导率和正常开花率低下仍是兰花试管开花技术应用的主要障碍。本试验结果表明，建兰小桃红与寒兰的杂交后代的切根试管苗、根状茎、根状茎薄层的试管花诱导率分别为80%、61.67%和16.67%，正常开花率分别为26.67%、12.50%和1.67%，说明不同材料正常开花率差异大。试验中还发现，诱导试管花需要一定的胁迫处理，过度胁迫常常导致花芽的畸形，因此针对根状茎、试管苗、薄层的特点需采用适宜的培养基和培养条件才可能获得较高的正常开花率。

目前，对兰花试管花形成过程的形态学观察及其细胞学机理的研究报道较少[24，40]，王琳[24]认为金钗石斛40 d有花原基出现，随后出现萼片原基，50 d有新月形的萼片，60 d有花瓣原基出现，70 d形成花瓣。本实验经过观察兰属兰花试管花的形成和发育过程，把兰花试管花形态发生过程分为花芽诱导期、花芽形态建成期、开花期和谢花期4个时期，并根据根状茎试管花的细胞学发生过程，将试管花形成过程分为花序原基形成期、花序原基分化期、小花原基形成期和小花原基分化期4个时期，这为根据不同时期的特点进行精细调控，进一步提高正常开花率，阐明试管花形成的分子机理奠定基础。

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