红色荧光蛋白基因银耳表达载体的构建及表达鉴定

阮玲云 翁彩红 陈世友 陈文星 赖春芬 艾柳英 胡开辉 孙淑静

摘  要  以pET-28a-RFP质粒为模板，PCR扩增红色荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）基因，并克隆到真核表达载体pTE11上，置于RP27启动子调控之下，成功构建表达载体pTE11-RFP。采用PEG介导转化法，将pTE11-RFP转入银耳芽孢中。提取转化子基因组DNA，RFP基因特异性引物扩增获得与目的基因大小一致的特异条带;日光下肉眼观察转化子略显红色，荧光显微镜观察有明显的红色荧光。以上结果证明RFP基因已成功转入银耳芽孢并进行表达，RP27启动子可以调控外源基因RFP在银耳芽孢中的正确表达，为进一步研究外源基因在银耳芽孢生物反应器中的高效表达奠定了一定的基础。

关键词  银耳芽孢;红色荧光蛋白基因;表达载体

中图分类号  S567.34          文献标识码  A

Construction of Plasmid Vector and Expression

Identification of RFP Gene in Tremella fuciformis

RUAN Lingyun， WENG Caihong， CHEN Shiyou， CHEN Wenxing，

LAI Chunfen，AI Liuying，HU Kaihui， SUN Shujing*

College of Life Sciences， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract The RFP （red fluorescent protein）gene was obtained by polymerase chain reaction（PCR）in which plasmid pET-28a-RFP was used as a template， and cloned into pTE11 vector under the control of RP27 promoter. The recombinant plasmid pTE11-RFP was successfully constructed as confirmed by enzymatic digestion and DNA sequencing. The PEG mediated transformation method was performed to transfer plasmid DNA of pTE11-RFP into yeast-like conidia of Tremella fuciformis. The expected amplified bands appeared when the chromosomal DNA of the transformants was used as the templates for the PCR with the RFP-specific primers. The colonies showed pink in tube and distinct red fluorescence could be observed from the colonies of YLCs by fluorescence microscopy. These results indicated that RFP gene was integrated into the genome of T. fuciformis and was expressed successfully by the regulation of RP27 promoter which laid the foundation for foreign gene expression in YLCs of Tremella fuciformis.

Key words  Tremella fuciformis;RFP gene;Expression vector

doi  10.3969/j.issn.1000-2561.2015.10.015

银耳（Tremella fuciformis Berk.）也称白木耳，主要含有蛋白质、碳水化合物、多种维生素和氨基酸等，是一种经济价值很高在中国医学中久负盛名的一种食药用真菌[1]。银耳的主要功能成分是多糖，具有辐射防护[2]、抗肿瘤[3]、抗氧化[4]、抗溃疡[5]、保肝作用[6]、促进神经细胞生长及改善记忆力[7]、淬灭致病细菌群体感应[8]等多方面的活性功效。银耳子实体和芽孢均可食用，因其具有特殊的二型性生活史，既可采用人工栽培，又可以酵母状芽孢的形式进行大规模发酵生产，因而成为遗传转化的理想材料[9]。目前已实现绿色荧光蛋白基因（gfp）[10-12]、人胰岛素基因（BCA）[13]、透明颤菌血红蛋白基因（VHb）[14]、多功能纤维素基因（mfc）[15]、人乳铁蛋白基因（hlf）[16]、蜜蜂抗菌肽基因（AP）[17]、高赖氨酸蛋白基因（lys）[17-18]、潮霉素抗性基因（hph）[19]等转化银耳并建立了较为完善的遗传转化体系[19-20]。

红色荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）是1999年由Matz等[21]从一种名叫Discosomasp sp.的珊瑚虫体内分离出来的荧光蛋白，能在紫外线激发下发出红色荧光，因其荧光性质稳定，检测方便，能大量表达且对细胞没有毒性，可作为各表达系统中灵敏而有效的报告基因而倍受重视[22]。虽然红色荧光蛋白的应用暂时还不及绿色荧光蛋白（GFP）广泛，但由于其激发和发射波长较长（最大吸收波长为558 nm，最大发射波长为583 nm）的优点，可以避免自体荧光的干扰，具有比绿色荧光蛋白更高的信噪比[23-24]，将成为研究银耳芽孢中外源基因表达模式的一个重要工具。

本研究旨在探讨以pTE11中的RP27启动子调控RFP基因构建真核表达载体的可行性，检测pTE11-RFP基因在银耳芽孢中的转化及表达情况，为进一步研究外源基因在银耳芽孢生物反应器中的高效表达奠定一定的基础。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  供试菌株   银耳芽孢供试菌株为福建农林大学生命科学学院微生物工程实验室保藏菌种;大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞购买于TaKaRa公司（大连）。

1.1.2  载体   含有RFP基因的质粒pET-28a-RFP为福建师范大学黄义德老师赠送，pTE11真核表达载体为福建农林大学王宗华老师赠送。

1.1.3  试剂与引物   限制性内切酶BamHⅠ和SpeⅠ，PCR反应过程中所用的10×PCR Buffer、dNTP Mixture、rTaq酶和DNA Marker等均为TaKaRa公司（大连）产品;质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自Omega Biotek公司;T4 DNA连接酶为赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）产品;潮霉素B购自美国Calbiochem公司;溶壁酶为广东省微生物研究所生产;胰蛋白胨（Tryptone）和酵母粉（Yeast Extract）为英国Oxoid公司产品;其余常规试剂为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4  培养基及溶液的配制   LB培养基：胰蛋白胨 10 g、酵母粉 5 g、NaCl 10 g，蒸馏水定容至1 L，pH 7.0-7.2;完全培养基（CM）：葡萄糖 20 g、蛋白胨 2 g、酵母膏 2 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 0.46 g、MgSO4 1 g，蒸馏水定容至1 L，pH自然;再生培养基（RM）：麦芽糖 10 g、葡萄糖 10 g、蛋白胨 2 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 0.46 g、MgSO4 1 g、0.6 mol/L的KCl、琼脂20 g，蒸馏水定容至1 L，pH自然;TPB缓冲液：0.6 mol/L KCl，25 mmol/L CaCl2·H2O;以上培养基及溶液0.11 MPa灭菌20 min备用。选择培养基（SM）：RM培养基中加入过滤除菌的潮霉素，终浓度为100 μg/mL。PEG/S：往TPB缓冲液中加入聚乙二醇（PEG）4 000，使缓冲液中PEG终浓度为40%（W/V），过滤除菌。溶壁酶液：用0.6 mol/L KCl配制成2%（W/V）浓度的酶液，过滤除菌，4 ℃保存备用。

1.2  方法

1.2.1  重组质粒的构建与鉴定   以pET-28a-RFP为模板，用分别含有BamHⅠ和SpeⅠ酶切位点的引物RFP-F和RFP-R扩增RFP全长基因，扩增条件：94 ℃预变性5 min（表1）;94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环;72 ℃延伸5 min。参照分子克隆实验基本操作[25]及试剂盒说明书用BamHⅠ和SpeⅠ对扩增出的RFP片段和载体pTE11进行酶切、连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布Amp抗性的LB筛选平板，挑取阳性克隆进行双酶切和测序验证，将验证正确的重组质粒命名为pTE11-RFP。

1.2.2  银耳芽孢的培养   将实验室保藏的银耳芽孢接入斜面培养基中，25 ℃活化培养4 d后取2环接入100 mL液体完全培养基（CM）中，于25 ℃、110 r/min的摇床中发酵培养5 d。

1.2.3  PEG介导转化银耳芽孢   取适量银耳芽孢发酵液，离心收集沉淀，用0.6 mol/L KCl洗涤2次后加入2%（W/V）的溶壁酶溶液，35 ℃水浴酶解约2 h，离心沉淀原生质体，加入适量的TPB缓冲液使原生质体终浓度为1×108个/mL。取处理后的银耳芽孢100 μL与1.0 μg重组质粒pTE11-RFP轻轻混匀，冰水浴5 min后加入50 μL的PEG/S，轻轻混匀，继续冰浴5 min。再加入1 mL的PEG缓冲液，充分混匀后于25 ℃水浴30 min， 40 ℃热激20 min，用再生液体培养基稀释到合适浓度后，涂布于SM培养基，25 ℃培养6 d[26]。

1.2.4  转化子的筛选与鉴定   将在SM平板中长出的银耳芽孢单菌落转接至含有150 μg/mL的潮霉素的筛选培养基中进行复筛，挑取长势较好的菌株至100 mL液体完全培养基中25 ℃、110 r/min摇床培养5 d，采用改良的CTAB法[27]提取转化子和出发菌株的基因组DNA，并以此为模板，分别用引物RFP-F、RFP-R和Hpt-F、Hpt-R对转化子DNA中RFP基因和潮霉素抗性基因hph进行PCR鉴定，其扩增条件分别为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环;72 ℃延伸10 min和94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸1 min，30个循环;72 ℃延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带。荧光显微镜在10×物镜下用绿光（波长范围：500～570 nm）对转化子和原始菌株进行对比观察，拍照。

2  结果与分析

2.1  重组质粒的鉴定

2.1.1  菌落PCR鉴定   挑取阳性单克隆用RFP特异性引物PCR扩增得到约680 bp左右的条带，产物大小与理论预测片段大小基本一致（见图1），初步判断重组质粒中含有目的基因RFP基因。

2.1.2  酶切鉴定   重组质粒经过 BamHⅠ和SpeⅠ双酶切，电泳结果显示有两条带（见图2），其中一条带大小680 bp左右，另一条约为6 800 bp，符合连接片段的大小，故可以判断所获质粒为重组质粒pTE11-RFP。

2.1.3  测序鉴定   将测序结果提交NCBI在线比对分析，与GenBank中发表的RFP基因序列同源性为100%。综上实验结果可判断所获得的质粒确实为重组质粒pTE11-RFP，载体构建成功。

2.2  银耳芽孢转化子的鉴定

2.2.1  PCR鉴定   提取的转化子和出发菌株的基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果见图3，条带完整。采用PCR检测目的基因RFP和潮霉素抗性基因hph结果如图4，电泳结果显示转化子能获得680 bp左右的目的基因条带及1 000 bp左右的潮霉素抗性基因条带，而原始银耳芽孢基因组DNA均未扩增出任何条带，表明该转化子已经成功转入RFP基因。

2.2.2  荧光观察   在普通日光下观察转化子即可看到微红色，而将转化子放在荧光显微镜下用绿光（500～570 nm）在10倍镜下观察，可明显看到转基因细胞发出红色荧光，而原始菌株细胞未见任何荧光（见图5），证实外源红色荧光蛋白在银耳芽孢中表达成功，RP27启动子可以调控外源基因在银耳芽孢中的正确表达。

3  讨论与结论

通过基因重组技术生产高价值的外源性蛋白质是当今生物技术研究与开发的热点之一，高效表达及纯化外源蛋白的关键是要有一个适合的表达系统，银耳的双型性（芽孢和菌丝体）赋予它作为生物反应器既具有与原核生物、酵母菌一样后代稳定的优点，又克服了大肠杆菌表达系统由于其蛋白质翻译后修饰加工系统不完善及含有内毒素，表达产物以包涵体形式存在，产物不易纯化及表达真核生物的基因产物活性低等问题[28-29]，又具有高等生物分化发育过程，是进行遗传转化研究的理想材料;目前已转化并整合到银耳芽孢基因组中的人胰岛素基因（BCA）[13]、人乳铁蛋白基因（hlf）[16]、蜜蜂抗菌肽基因（AP）[17]等外源基因均只在DNA水平或者mRNA水平上检测到外源基因的存在，然而对外源蛋白在银耳芽孢中最终是否表达并未作出明确判断。高赖氨酸蛋白基因（lys）[18]、多功能纤维素基因（mfc）[15]、透明颤菌血红蛋白基因（VHb）[14]、潮霉素抗性基因（hph）[19]等虽然能够通过其他方式初步定性得到表达鉴定，但是只有达到一定表达量的转化子才能检测到表达产物，且具体产物与结构分析还需要进一步深入研究确定。

荧光蛋白由于其自发荧光的特性，在细胞生物学上有着广泛的应用。孙淑静等[30]曾将EGFP转化进银耳芽孢并证实了其可在银耳芽孢中表达，但因银耳芽孢本身颜色是浅黄色的，绿色荧光蛋白表达弱时为黄绿色，干扰了绿色荧光蛋白表达鉴定。红色荧光蛋白（RFP）基因是与绿色荧光蛋白（GFP）同源的荧光蛋白，其发光不需要其他因子的参与，且亮度高、荧光性质极其稳定，无毒性，表达产物可以用眼睛直接观察或者在紫外线激发下发出与银耳芽孢本底颜色差异较大的红色荧光[21，31]。因此将红色荧光蛋白基因作为报告基因与外源目标蛋白融合表达后，即使外源基因在低水平表达时也可以方便灵敏地通过荧光检测出外源基因是否表达以及表达量的高低，此外还可以在不破坏细胞活性的情况下对目标蛋白进行定位，是外源基因表达非常方便的标记物和监测方法。目前RFP基因已被广泛应用于动物、植物、酵母等真核细胞内基因表达的报告基因，但是尚未见其在银耳芽孢中的研究报道。因此本研究构建含有红色荧光蛋白RFP基因的表达载体，采用RFP进行表达分析。

虽然银耳芽孢作为新的外源基因表达系统克服了以往大肠杆菌、酵母菌表达系统的不足之处，具有无可比拟的优越性，但其自身也存在着一些问题。主要是遗传背景不清楚，外源基因在银耳芽孢中表达量低，原因至今尚未阐明。外源基因在生物中表达量低受多种因素影响，如表达体系、启动子和增强子等，从而表现出表达量低、蛋白量少、不稳定以及基因沉默等，因而必须从这些因素入手，在不同水平上对基因进行调控，寻找提高外源基因表达效率的有效途径。目前银耳表达外源基因可以采用双孢蘑菇（Agaricus bisporus）gpd（glyceraldehyde-

3-phosphate dehydrogenase， 3-磷酸甘油醛脱氢酶）启动子[27]、 银耳内源gpd启动子[11，15]、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）gpd-An启动子[19]、 香菇（Lentinus edodes）gpd-Le启动子[19]、 CaMV35S启动子[13]等， 但表达效率不够理想。本实验所采用的启动子RP27来自丝状真菌的重要模式生物-稻瘟病菌（Magnaporthe grisea），同时也是是真核表达载体pTE11自带的强启动子。该启动子已实现丝氨酸蛋白酶基因（MGG07965.60[32]、 漆酶基因（Laccase）[33]、 MgCdc42基因等[34]外源基因的过量表达。本研究首次采用强启动子RP27来调控外源基因在银耳芽孢的表达，并选用了红色荧光蛋白（RFP）作为目的基因，证明RP27启动子在银耳芽孢中可以正确地调控RFP基因的高效表达，从而可以利用该启动子转化其它药用蛋白基因并作表达量检测，为进一步利用荧光蛋白基因作为报告基因和筛选标志及验证启动子活性提供一定的参考依据，对外源基因在银耳生物反应器中的高效表达研究有重要意义。

致谢  感谢福建农林大学真菌实验室王宗华研究员、福建师范大学黄义德副教授质粒的馈赠与实验的指导，感谢福建农林大学真菌实验室陈晓峰博士后和福建农林大学生命科学学院林聪老师在本实验中给予的支持与帮助！

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