白僵菌生产中发酵罐培养技术研究

戈媛媛 赵东容 沈伟清 张建华

摘要：为掌握白僵菌发酵罐培养技术，白僵菌可工业化生产，以宜昌夷陵区白僵菌菌种为材料，对白僵菌液体发酵罐发酵培养的培养基、菌种生长形态、生长环境的pH值进行试验研究，从而确定转罐时间等液体发酵罐发酵技术参数。结果表明：在液体发酵培养中，碳、氮、磷为白僵菌生长必需的三要素，不同生长时期三要素比例不同，初期加入少量微量元素有助于提高白僵菌孢子生长速率和增加数量;在白僵菌液体发酵生长史中，初始pH值为6，继而在pH值4～5的环境中生长速率最快;前42～45h在种子罐中主要产菌丝体，在转罐后21～26h发酵罐中主要产孢子体。

关键词：白僵菌;液固两相发酵技术;发酵罐;工业化

中图分类号：S476.12文献标识码：A文章编号：1004-3020（2015）03-0029-04

TechnologyResearchofLiquidFermentationTankCultureofBeauveriabassiana

GeYuanyuan（1，2）ZhaoDongrong（1，2）ShenWeiqing（2）ZhangJianhua（1）

（1.DangyangCityForestPestControlandQuarantineStationYichang444100;

2.BeauveriaBassianaFactoryofDangyangCityForestPestControlandQuarantineStationYichang444100）

Abstract：InordertomasterthetechnologyoffermentationcultureofBeauveriabassiana，andputthecultureofexpandingBeauveriabassianaintoindustrialproduction，weusedBeauveriabassianastrainofYilingdistrict，YichangasthematerialandfermentationtechnicalparameterssuchastheappropriateliquidfermentationmediumandthegrowthmorphologyofstrainandpHvaluesofgrowthenvironmentwerestudiedbyliquidfermentationtankculturewhichcouldhelpidentifythetimeoftransferringliquidfromseedtanktofermentationtank.TheresultsshowedthatCarbon，NitrogenandPhosphoruswerethreekindsofnecessarynutrientelementsintheliquidfermentation.Besides，thesethreeessentialfactorsforthegrowthofBeauveriabassianahaddifferentproportion，theadditionofasmallamountofmicroelementintheliquidfermentationmediumattheearlystagecouldincreasegrowthrateandthenumberofBeauveriabassianaevidently;Beauveriabassianahasthecyclicgrowthhistorythatismutualtransformationbetweensaprophyteandmyceliuminitsmultistagecontinuousliquidfermentation，andthecomparativeanalysisofsporeformandthenumbersshowedthatthefastestgrowthappearedinthepHvaluebetween4and5whichthegrowthenvironmentofBeauveriabassianaownedbyselfregulationandartificialadjustment，althoughwehadgivenconditionthatthemediumwasapHof6initially;ConsideringthegrowthmorphologyandthenumberandtheactivityofBeauveriabassianaandtheworkshopoperationschedule，wemadethefollowingarrangements，andthefirstprocesswasproducingmyceliumintheseedtankfor42～45hours，andthesecondonewasproducingsaprophytewhichwasthestrainofsolidfermentationproductioninthefermentationtankfor21to26hours.

Keywords：Beauveriabassiana;solidliquidtwophasefermentationtechnology;fermentationtank;industrialization

白僵菌Beauveriabassiana是一种半知菌类的虫生真菌，通过附着于虫体表面，产生脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶溶解昆虫的表皮，穿透昆虫体壁在昆虫体内大量增殖，消耗寄主体内养分，并不断产生白僵素（大环脂类毒素）和草酸钙结晶[1]这些物质，引起昆虫中毒，使体液机能发生变化，打乱新陈代谢以致死亡。从1890年美国的堪萨斯州将白僵菌供应给农户防治麦长蝽[2]，到1939年苏联的波斯必洛夫和谢胡里娜利用白僵菌防治森林害虫松尺蠖，至今，由于白僵菌高孢粉无毒、无味、无环境污染、害虫一经感染可持续传播等优势，白僵菌高孢粉已被作为国家林业局推广的高效生物杀虫剂之一，广泛应用于松毛虫、玉米螟、蛴螬等60多种农林害虫[1]。而同大多数应用于医疗、工业中的真菌生产一样，白僵菌菌种培养也经历由液体、固体培养基单纯性发酵到液固两相发酵的改革。液固两相发酵法将液体深层发酵和固态发酵两种方法相结合，克服单纯液体发酵生产的芽生孢子稳定性差的缺点，尽可能多的避免了由生产周期长造成的发酵中毛霉、黄曲霉等杂菌污染，以及随气候温、湿度变化的影响造成“烧盘”[3]等现象，最大限度地利用了固体表面上产生气生分生孢子的优点，同时缩短了菌丝生长周期，生产方法简便，原料易得，能耗成本低。因此，利用液固两相发酵规模化、高科技、高效率生产意义重大，更有广阔前景。在此笔者通过长期实验，并同湖北省当阳市森防站白僵菌厂规模生产实践，于2014年成功进行发酵罐生产高孢粉7t的基础上，对液固两相发酵技术中白僵菌发酵罐培养进行初步研究，为白僵菌扩大培养从而投入工业化生产提供科学依据。

1材料与方法

1.1菌种的制备

将选育的优良菌种（使用的是从宜昌夷陵区僵虫身上分离提纯的白僵菌菌种）在超净无菌工作台上进行接种。让母种先在摇瓶或小罐内进行发酵培养，然后转移到大罐中发酵，大型发酵罐的菌种要经过两次扩大培养才能接入发酵罐[4]。

摇瓶培养是指在250mL三角瓶中装入50mL液体培养基，121℃、0.15MPa灭菌0.5h后经冷却接入菌种，置于26℃的恒温摇床上培养至发酵罐准备工作完毕即可。同时将种子罐、发酵罐在121℃、0.1MPa条件下进行空罐、实罐灭菌[5]1h;冷却至26℃，用微孔压差法或打开接种阀在火焰的保护下将摇瓶的菌种接入种子罐。

对摇瓶菌种和种子罐营养液接种前、后进行取样镜检，以确保上罐的菌种和培养基百分百无感染，并排除因种子罐接种环节的感染等因素，否则后面的生产将无法继续，所以在制备摇瓶菌种时应多制备几组以备用。

1.2培养基研究

摇瓶培养基、种子罐培养基、发酵罐培养基均以培养真菌用的液体培养基PDA为基础，加以部分元素的改进。摇瓶培养基：土豆，葡萄糖，蛋白胨，KH2PO4，MgSO4·7H2O，FeSO47·H2O，水;种子罐和发酵罐培养基：黄豆水，白砂糖，KH2PO4。

1.3发酵罐液体菌种培养

接种后进行种子罐-发酵罐两级连续发酵[1]培养：第一罐即种子罐，在给予罐体积的70%的培养液中接种量为5%，发酵温度26±1℃，pH6.0，无菌空气流量为常压下8m3/h，搅拌转速为120～140r/min，第二罐发酵罐，同样给予罐体积70%的新的培养液，以种子罐发酵后液体为菌液，发酵温度26±1℃，pH5.8，无菌空气流量为常压下80m3/h，搅拌转速220～240r/min。根据上种子罐后不久、种子罐移种至发酵罐前，几个重要时期及在菌种上种子罐后14，24，34，44h，种子罐移种发酵罐18，22，26h取样显微镜观察白僵菌形态和染色镜检、pH值检测，判定感染与否以确保种子质量和决策生产流程。

1.4数据处理

各形态孢子和代谢产物草酸钙结晶以直接计数法计数总数量，部分数据采用Excel2003进行统计记录。

2结果分析

2.1发酵罐培养基

碳、氮、磷是白僵菌生长不可缺少的营养元素，而在白僵菌生长的不同阶段培养基成分又各有不同：产菌丝体时需要的营养丰富一些，氮较产孢期需要的多，而产孢期则需要的碳多，种子罐中碳源氮源比例为2∶3，发酵罐碳源氮源比例为1∶1;培养初期在营养液中加入少量的微量元素，比如锰和铁[2]，有助于白僵菌孢子生长速率和数量的增加。

见以上表1：通过多次实验，在给予相同菌种接种量、氮源、磷盐，不同碳源的培养条件下，26℃水浴恒温摇床培养，得出以下结论：白僵菌在对碳的利用中，对双糖中的蔗糖利用效果要优于单糖中的葡萄糖。由分生孢子发芽成芽管进而生长成菌丝的过程中，利用蔗糖作为碳源的白僵菌要比用葡萄糖作为碳源的白僵菌生长进度快、长势好，节约培养时间。因此在大量生产条件下，粗制白砂糖可作为白僵菌碳源的首选。

氮源：玉米浆或黄豆水为白僵菌发酵的主要氮源。因为是工业化生产，考虑到成本问题，玉米和黄豆作为菌种培养的氮源比较有优势。但玉米浆制成的培养基液体比较浑浊，制片不利于镜检，所以主要还是选用黄豆熬水作为氮源。

磷盐：为了维持培养基pH的相对稳定，让微生物生长速度朝着我们工业化生产有利的方向进行，通常在培养基中加入pH缓冲剂。由于白僵菌在偏弱酸的环境中生长速度快，因此我们选用水溶液呈酸性的KH2PO4作为磷盐的主要来源。

2.2培养时间和白僵菌形态

要想缩短周期、扩大生产、获得生理状态良好的孢子，掌握白僵菌发酵罐培养的各时段形态具有重要意义。

白僵菌菌种自接入液体培养基后，生活史的一个循环周期：分生孢子——发芽成芽孢子——萌发成芽管，芽管分枝上断截产生节孢子——萌发成菌丝——继续生长并产生草酸钙结晶，部分老化断裂增殖产生更多节孢子——老化的菌丝减少至无，节孢子萌发成新菌丝。

白僵菌发酵罐培养生长曲线图中，可以看出：在44h的节点，给予菌种转入发酵罐的方式补充营养，可以使白僵菌继续扩大繁殖，生长曲线也直接由稳定期跨过衰亡期进入下一个生长循环期，大大减短了培养时间，扩大了菌种繁殖;在66h后，发酵罐中菌种受代谢产物、营养物质匮乏等限制，菌种增量不明显甚至下滑趋势，延长培养时间已没有太大意义，因此可停止发酵罐培养。

2.3酸碱度-时间曲线

每次投罐发酵培养中，初始给予菌种相同pH值的营养环境。从表4可以看出：白僵菌生长的适应环境为pH值4～6;总体以白僵菌发酵培养44h为界点，0～44hpH值由6减至4，为产生第一代新菌丝阶段，63h后pH值呈现由4增值的趋势，是菌丝逐渐老化代谢产生结晶和节孢子演变生成第二代菌丝，以节孢子为主的过程，此后就是菌丝与节孢子之间的循环演变，白僵菌的扩大繁殖。在此，人为的将白僵菌液体发酵培养时间分配成种子罐42～45h，发酵罐21～26h。

3结论与讨论

在生物学界和农林业系统经过专家们长时间努力，在白僵菌育种方面已取得巨大成就，但同许多其它现代生物技术类似，白僵菌扩大培养获得的成果在全国大部分地区未能产业化，瓶颈是发酵罐中稳定的控制和顺利的后处理不能通过的问题。因此白僵菌工业生产技术仍是良莠不齐，从实验室菌种选育到车间发酵罐大量生产，如何掌握好液体发酵罐培养中白僵菌多型孢子和菌丝各生长形态所适应的环境和所需要的营养元素，保障白僵菌菌种发酵按预定的最佳动力学过程进行，才是做到从量变到质变的生产工艺之关键。

笔者通过以宜昌夷陵区白僵菌菌种为材料，对白僵菌液体发酵罐发酵培养的培养基、菌种生长形态、生长环境的pH值进行试验研究，在当阳白僵菌厂成功投入工业化生产的基础上，确定了转罐时间等液体发酵罐发酵技术参数。结果表明：在液体培养基中，碳氮元素比例为种子罐2∶3，发酵罐1∶1;种子罐初始pH值为6，进入发酵罐生产，pH值在白僵菌自我调节与外界调节共同作用下维持4～5，孢子增长速率最大;积极掌握白僵菌液体发酵中节孢子与菌丝生长时间，从而合理分配种子罐-发酵罐两级连续发酵培养时间，前42～45h在种子罐中培养，后21～26h在发酵罐中补充新料继续培养。以最大程度节约生产成本，进行成功生产。另外对比固体发酵法生产和液固两相发酵工业化生产，虽然后者因为空压机、发酵罐运行耗电较前者多，但综合考虑，无论是从生产成本还是产品质量产量上考量都要较前者优秀，因此液固发酵法生产拥有广阔前景。

参考文献

[1]沈萍，陈向东.微生物学[M].北京：高等教育出版社，2006.

[2]李远帷，吕昌仁，陶恒才.白僵菌的生产和应用[M].北京：中国林业出版社，1981.

[3]赵东容，孟远兰，郭志红，李兰珍.卵孢白僵菌生产工艺[J].苗圃金龟子生物防治技术.1997，（4）：36.

[4]夏焕章，熊宗贵.生物技术制药[M].北京：高等教育出版社，2006.

[5]殷凤鸣，潘务耀，李增智.白僵菌生产企业标准[J].安徽农业大学学报.1996，23（3）：321325.

（责任编辑：郑京津）