单细胞多重替代扩增法结合比较基因组杂交技术检测植入前发育停滞胚胎染色体非整倍性

石青青，孙海翔

(南京大学医学院附属鼓楼医院 妇产科，江苏 南京 210008)

胚胎染色体的非整倍性改变可影响胚胎的发育［1］。临床上很多体外授精的胚胎在植入前体外培养的过程中即出现发育停滞，使用标准的形态学方法很难鉴别此胚胎染色体是否为非整倍性染色体，这需要使用植入前遗传学诊断技术来鉴定［2－3］。比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)技术是在荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)基础上发展起来的的一种分子细胞遗传学技术，仅需少量DNA 经过一次杂交就可以对全基因组进行全面的评估，该技术还无需细胞培养和预先了解需检测的染色体区域，但临床上为了减少胚胎的损伤，仅能取单个卵裂球进行PGD 检测，而单个卵裂球所包含的DNA量有限，不足以用于CGH 检测。全基因组扩增(whole genome amplification，WGA)技术是一种非选择性扩增全基因组DNA 序列的技术，它能如实反映基因组全貌，并对DNA 大量复制［4］。本次研究应用WGA 技术中稳定性强、特异性高、保真性好的多重置换扩增法(MDA)结合CGH 技术对70枚植入前发育停滞卵裂球进行检测，筛查植入前胚胎非整倍性染色体，分析植入前发育胚胎发育停滞的病因机制。

1 对象和方法

1.1 研究对象

从生殖中心2011 年植入前6 ～8 细胞期发育停滞的胚胎中，随机选取70 枚，通过透明带激光打孔辅助卵裂球吸拉法，每枚胚胎各取出卵裂球一枚，分别放入0.5 mL PCR 管内。正常男性肝素抗凝新鲜外周血2 mL，经淋巴细胞分离液分离得到单个核淋巴细胞，梯度稀释于生理盐水内，于倒置显微镜下挑取单个淋巴细胞，放入0.5 mL PCR 管内，待用。

1.2 方法

1.2.1 MDA 和染色体标本制备 MDA 及其产物检验试剂(single cell WGA kit)购于美国Sigma 公司，步骤:(1)裂解细胞，去离子水9 μL 及新鲜制备的裂解缓冲液1 μL(包含蛋白酶K 及10×单细胞裂解缓冲液)，PCR 程序，50 ℃、1 h，99 ℃、4 min;(2)模板制备，1×单细胞模板制备缓冲液2 μL及模板稳定液1 μL，PCR 反应，95 ℃、2 min，置于冰上冷却，加入模板制备酶1 μL，PCR，16 ℃、20 min，24 ℃、20 min，37 ℃、20 min，75 ℃、5 min，4 ℃、10 min;(3)扩增，加入10×扩增混合液7.5 μL，去核酸水48.5 μL，WGA DNA 聚合酶5 μL;PCR，95 ℃、3 min，94 ℃、30 s，65 ℃、5 min，共25 个循环;4 ℃、10 min。通过比色法及1%琼脂糖凝胶电泳检验扩增结果，用常规方法制备正常男性淋巴细胞中期染色体。(此为Sigma 公司MDA 商品化试剂盒内的试剂，以及试剂盒内附操作步骤)

1.2.2 CGH 杂交 (1)单细胞WGA 产物沉淀:在扩增产物PCR 管中加入3 mol/L NaAc 5 μL，－20℃无水乙醇125 μL，混合均匀后瞬时离心，放入－70 ℃沉淀1 h。4 ℃12 000 r/min 离心30 min，吸去上清液，用75%乙醇洗涤沉淀2 次。4 ℃12 000 r/min 离心5 min，吸去上清液。于空气中干燥。(2)DNA 切口平移与荧光标记:50 μL 体系，沉淀DNA 的PCR 管内加入10×PolyI buffer 5 μL，dTTP 5 mL，dNTP 10 μL，PolyI 2 μL，Spectrum Green/Spectrum Red dUTP 2.5 μL，DnaseI 1 μL，去离子水24.5 μL。漩涡振荡混匀后瞬时离心，15 ℃酶切，片段大小集中在250 ～750 bp，PCR 仪上70 ℃10 min 终止反应。单个卵裂球扩增产物标记绿色荧光作为待测样本，正常男性外周血单个淋巴细胞扩增产物均标记了红色荧光作为对照样本。(3)杂交:两种标记探针各取30 μL，混合后加入人类Cot－1 DNA 10 μL，3 mol/L 醋酸钠5 μL、无水乙醇125 μL，充分混匀，－80 ℃沉淀1 ～2 h。4 ℃12 000 r/min 离心30 min，用75%乙醇洗涤沉淀，吸去上清液，于空气中干燥。探针溶于10 μL 杂交缓冲液(50%去离子甲酰胺，2×SSC，10%硫酸葡聚糖、pH=7.0)，将探针和染色体玻片共变性73 ℃5 ～6min;37 ℃孵育箱中杂交48 ～72 h 杂交。(4)洗片及分析:0.1%NP40/2×SSC，37 ℃，洗片3 min;在黑暗中常温干燥;加抗荧光淬灭DAPI 30 μL。(5)CGH 图像的获取以及分析Lecia 荧光显微镜下选择中期染色体分散，信号光滑背景较低的区域用ASI 分析软件进行分析，每一染色体上绿红2 种信号叠加后会形成一定的荧光强度比(FR)，通过分析荧光强度比，即可制作出CGH 拷贝数核型模式图，正常染色体的绿红比值为0.85 ～1.15，绿红比值≤0.75 时判断为染色体丢失，≥1.25 时判断为染色体扩增。

2 结果

在检测的70 枚卵裂球中，有7 枚出现染色体的非整倍性改变，其中2 枚卵裂球染色体为46，XY，dup(Y)(q12);其余5 枚卵裂球的染色体分别为45，X;47，XY+21;47，XY+1;46，XY，dup(17)(q23);46，XX，dup(20)(p12)。染色体异常的发生率为10%。见图1。

3 讨论

自1993 年Munné 对人类胚胎非整倍性筛查开始至今，很多体外授精病人的妊娠失败都是由于胚胎的非整倍性造成的［5－6］。但是不同类型的染色体非整倍性改变对胚胎发育的影响不同，并且染色体非整倍性改变出现在胚胎发育的不同阶段对于胚胎发育的影响也不同。在人类活产婴儿中，13、18、21 和性染色体的非整倍体改变占染色体数目异常的95%。对于植入后发育停滞胚胎进行研究发现，常染色体三体改变最为常见，其中15、16及22 号染色体3 体异常发生率较高，其次为性染色体单体改变及结构重排［7－8］;还有一部分胚胎在着床前体外培养时就会出现发育停滞的现象。本研究立足于染色体的非整倍性改变，通过MDA 结合CGH 方法对植入前即发育停滞的胚胎进行检测，以期发现这种发育停滞是否与染色体的非整倍性有关，以及何种类型的染色体非整倍性改变可以引起胚胎在植入前发育停滞。

本研究的70 枚植入前发育停滞的卵裂球中，7枚出现染色体非整倍性改变，且非整倍性改变的类型各不相同，染色体异常的发生率为10%，表明本研究中染色体异常的发生比例较高，且非整倍性改变的类型与既往研究的妊娠胚胎发育异常的类型不同［9］。本次研究挑选6 ～8 细胞期的胚胎卵裂球，最大限度降低了染色体嵌合现象(即同一胚胎的不同卵裂球中的染色体组成不一致的现象)引起的异常染色体的漏检。本次研究的不足是CGH技术，检测扩增和缺失的灵敏度约为2 Mb，一些微小的扩增或缺失无法检测，导致实际染色体非整倍性改变比例应高于检测比例。因此，植入前发育停滞的胚胎中的胚胎存在染色体非整倍性改变比例应高于10%，说明染色体非整倍性改变可能导致植入前胚胎的发育停滞。

图1 植入前发育停滞卵裂球染色体非整倍性改变Fig.1 Chromosome aneuploidy of blastomeres of arres ted development before implantation

胚胎发育停滞原因复杂，与自然妊娠的胚胎发育停滞不同，植入前胚胎发育停滞可能与下列因素有关:(1)氧自由基伤害，胚胎在早期对于外源性氧化损伤的敏感性很高，自身抗氧化保护的机制发育尚未完全;有学者发现，用胚胎在体外培养时，培养液中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)增高后可引起小鼠早期胚胎发育阻滞，当外源性地补充抗氧化的酶类后，就可以避免体外培养和操作带来的ROS 损害［10－11］;(2)培养液成分不平衡，与体细胞不同，早期胚胎发育代谢机制具有其特殊性;体内环境中不同的养分以不同的量和形式存在，它们彼此保持着一定的平衡关系，也正是这种平衡体系为胚胎发育提供了适合的发育环境;培养液平衡体系一旦打破，那势必会影响胚胎的发育;阻滞就不可避免;(3)胚胎冷冻损伤，主要认为是由于胚胎的线粒体等受损从而诱导细胞发生凋亡，造成胚胎发生阻滞［12－14］。

本次研究成功应用单细胞MDA 结合CGH 技术对植入前胚胎全基因进行检测，筛选出植入前胚胎非整倍性的染色体，表明染色体非整倍性改变可能是植入前胚胎的发育停滞的原因之一。

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