中心组合-效应面法优选黔产铁苋菜总黄酮超声提取工艺

蒙慧彤，李雪营，赵鸿宾，魏学军(黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000)



中心组合-效应面法优选黔产铁苋菜总黄酮超声提取工艺

蒙慧彤，李雪营，赵鸿宾，魏学军*
(黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558000)

目的：优选黔产铁苋菜总黄酮的超声提取工艺。方法：以总黄酮转移率为响应值，在单因素试验基础上，采用中心组合-效应面法研究液固比、乙醇浓度、超声时间及其交互作用对总黄酮转移率的影响。结果：最优提取工艺参数为：乙醇浓度70%，用量33倍，提取2次，每次31min。结论：本试验优选的提取工艺稳定可行。

黔产铁苋菜；总黄酮；中心组合；效应面法；提取工艺

铁苋菜为大戟科植物铁苋菜AcalyphaaustralisL.的干燥全草,含黄酮、生物碱、鞣质等化学成分，具有清热利湿、收敛止血的功能[1]。由于采集方便，疗效显著，在贵州黔南苗族聚集区应用广泛，苗药亦称“海蚌含珠”[2]。研究表明，其所含总黄酮具有抗菌、消炎、抗衰老和增强机体免疫等作用[3-6]，具有良好的开发利用前景。本文首次采用中心组合-效应面法(CCD-RSM)对影响黔产铁苋菜总黄酮超声提取的因子及因子间的关系进行研究，优选提取工艺参数和建立预测模型，为铁苋菜的进一步开发利用提供实验性理论依据。

1 仪器与试药

Cary-100型双光束紫外可见分光光度计(北京安捷伦公司)；SY-1000型超声波提取仪(北京西化仪公司)；OR型低速离心机(德国HERAEUS公司)；AE240型电子天平(瑞士METTLER公司)。芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100080-200707)，其他试剂均为分析纯。铁苋菜药材采于本校药用植物园，经鉴定为大戟科植物AcalyphaaustralisL.铁苋菜的干燥全草，样本留存于本校中药标本室。

2 方法与结果

2.1 铁苋菜总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取一定量芦丁对照品，加入60%乙醇溶解并于50mL容量瓶中定容，摇匀后得 0.102 4mg/mL的芦丁对照品液。

2.1.2 标准曲线的制备 精密移取芦丁对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL分别置于10mL容量瓶中，加60%乙醇至5mL，加5%亚硝酸钠溶液0.5mL，摇匀放置6min，再加10%硝酸铝溶液0.5mL，摇匀放置5min，加4%氢氧化钠溶液4mL，摇匀放置12min。另取2.0mL蒸馏水作为空白对照，在515nm处分别测定吸光度，以芦丁浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，线性方程为：A = 7.498 3C + 0.002 2，R=0.999 5。试验结果表明对照品在10.24～61.44μg范围内线性关系良好。

2.1.3 供试品溶液制备 精密称取过3号筛干燥至恒重的铁苋菜粉末1.0g置具塞试管中，按单因素考察试验条件和中心组合试验安排进行超声提取，趁热抽滤，滤液于水浴上浓缩至无醇味，放凉后加60%乙醇定容至50mL容量瓶中，摇匀，冷藏备用。

2.1.4 总黄酮含量测定 精密移取上述供试品溶液2.0mL，按“2.1.2”项标准曲线制备条件测定总黄酮，计算总黄酮转移率(mg/g)。

2.2 单因素考察

2.2.1 液固比 按“2.1.3”制备方法取样5份，在70%乙醇浓度、超声10min和超声1次的固定条件下，分别用10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的液固比提取，按“2.1.4”项测定。结果总黄酮转移率分别为2.81、3.14、3.32、3.37、3.38mg/g，转移率随液固比的增加而逐渐升高，超过30∶1后升高不明显，这与总黄酮的溶出渐趋平衡有关，从缩短浓缩时间的角度考虑，选择30∶1液固比为宜。

2.2.2 乙醇浓度 按“2.1.3”制备方法取样5份，在液固比 30∶1、超声10 min和超声1次的固定条件下，分别采用50%、60%、70%、80%、90%乙醇提取，按“2.1.4”项测定。结果总黄酮转移率分别为2.70、3.67、3.55、3.13、2.67mg/g，转移率在乙醇浓度超过60%后呈逐渐降低趋势，这与使用高浓度乙醇导致脂溶性杂质溶出增多，产生竞争抑制作用有关，故选择60%乙醇作为提取溶剂。

2.2.3 超声时间 按 “2.1.3”制备方法取样5份，在60%乙醇浓度、液固比30∶1和超声1次的固定条件下，分别提取10、20、30、40、50min，按“2.1.4”项测定。结果总黄酮转移率分别为3.23、3.94、4.30、4.35、4.06mg/g，提取超过30min后，转移率先升后降，原因与时间过长，乙醇挥发增多，降低了提取溶剂的浓度有关，故选择超声提取30min。

2.2.4 超声次数 按“2.1.3”制备方法取样3份，在60%乙醇浓度、液固比30∶1和超声时间30min的固定条件下，分别提取1、2、3次，按“2.1.4”项测定。结果总黄酮转移率分别为3.93、4.61、4.70mg/g，提取2次和3次差异不明显，从节约资源和缩短生产周期的角度考虑，选择提取2次为宜。

2.3 提取工艺条件筛选与结果

2.3.1 中心组合设计 综合单因素试验结果，选取液固比、乙醇浓度、超声时间对总黄酮转移率有显著影响的三个因素，确定各因素的上、下限，按中心组合确定因素及水平，见表 1。采用中心组合将因素水平设计成 15个实验组，其中 12个为析因实验，3个为中心实验，用以估计实验误差，实验结果见表 2。

表1 因素水平

表2 星点设计实验结果

2.3.2 效应面分析方案及结果 将所有条件和实验结果经 SAS RSREG回归，因子经过回归拟合，得回归方程为：Y=4.61+0.516 3X1-0.285 0X2+0.151 3X3-0.703 8X1X1+0.315 0X1X2-1.241 3X2X2+0.057 5X1X3-0.130 0X2X3-0.628 8X3X3。

回归方程中各变量对响应值影响的显著性用F检验判定，P值(概率)越小，则响应变量的显著程度越高，P<0.05表示显著影响，P<0.01表示影响极显著。回归分析结果见表3。

表3 回归分析结果

分析结果显示，模型回归P为0.004 0，说明模型显著可靠。液固比 X1、X1的平方项、X2的平方项、X3的平方项对总黄酮转移率影响极显著(P<0.01)；乙醇浓度 X2对总黄酮转移率影响显著(P<0.05)。模型的回归系数R2=0.964 6，说明总黄酮转移率变化的96.46%来自所选因变量，即液固比、乙醇浓度、超声时间的值。各因素对总黄酮转移率影响的顺序是：液固比(X1)﹥乙醇浓度(X2)﹥超声时间(X3)。

2.3.3 响应面优化和预测 利用Design Expert7.0软件，通过多元回归方程作出对总黄酮转移率影响显著的两个因素的响应面图和等值线图，响应面图的曲面顶端为最优值，结果见图 1。由回归方程解得实验最优工艺条件为：液固比33.46∶1，乙醇浓度59%，超声时间31.21min。在此条件下，铁苋菜总黄酮转移率理论值预测可达4.63mg/g。

图1 Y=f(X1,X2)的响应面图和等高线图

2.3.4 验证实验 为便于实际操作，将CCD-RSM求得的最优条件下整理为：液固比33∶1，乙醇浓度60%，超声时间31min。按此条件对铁苋菜总黄酮平行提取5份，结果见表4。

表4 验证实验结果 (n=5)

3 讨论

目前铁苋菜总黄酮的提取工艺均采用正交试验设计进行优选[5-6]，此设计方法是基于影响因素与总黄酮转移率呈线性模型的设计，即研究因子与响应值之间的关系，忽视了在最佳试验条件附近影响因素间的非线性变化，即因子与

因子之间的相互关系，因此预测性较差。CCD-RSM是采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，研究因子与响应值之间、因子与因子之间的相互关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法，具有良好的直观性、方便性及预测性，可用于药学领域内的相关研究[7-10]。

验证试验表明，按整合后的工艺进行提取，实际转移率与理论转移率相对误差为1.30%，RSD值为0.28%，说明此工艺是科学、合理的。本试验在单因素考察的基础上，对同批次样本开展了正交试验优选，结果显示总黄酮平均转移率为4.16mg/g，较CCD-RSM法试验结果4.57mg/g低，此结果验证两种方法间确实存在一定差异性。

[1] 卫生部药典委员会.卫生部颁药品标准(中药材第1册)[M].北京：人民卫生出版社，1992：71.

[2] 邱德文，杜江.中华本草(苗药卷)[M].贵阳：贵州科技出版社，2005：456-457.

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[4] 杨养贤，王晋源.中药铁苋菜的药理研究概况[J].现代中医，1997,10(2)：109-111.

[5] 梁曾恩妮，蒋道松，刘作梅，等.铁苋菜总黄酮提取工艺优化及其抑菌效果的初步鉴定[J].湖南农业科学，2008(2)：110-112.

[6] 王春景，刘高峰，李晶，等.铁苋菜黄酮类化合物的提取及清除羟自由基作用的研究[J].光谱实验室，2010,27(3)：797-802.

[7] 张明，倪颖，金伟华，等.星点设计-效应面法优化扶正生血胶囊纯化工艺[J]. 成都中医药大学学报，2013，36(3)：35-39.

[8] 谢臻，陈勇，曾海生，等.星点设计-响应面法优选地桃花中总黄酮的提取工艺[J].中国实验方剂学杂志，2011，17(12)：27-30.

[9] 陈家仪，贾薇，曾元儿，等.星点设计-响应面法优化枳实黄酮类成分的提取工艺[J]. 药物分析杂志，2012，32(7)：1267-1271.

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(责任编辑：魏 晓)

Optimization on Extraction of Total Flavonoids from Acalypha Astralis L. in Guizhou with Ultrasonic Wave by Central Composite Design-Response Surface Methodology

Meng Huitong，Li Xueying， Zhao Hong-bin，Wei Xuejun*
(Qiannan Medical College for Nationalities, Duyun 558000 China)

Objective:To study the optimum condition of extraction for the total flavonoids in Acalypha Astralis by central composite design-response surface methodology.Methods:Based on the single factor test，we study the effluence of liquid-solid ratio，ethanol concentration and ultrasonic time also with its interaction on the transfer rate of total flavonoids which was the response value.Results:The content of extraction conditions was 70% ethanol，ultrasound 33 min for 2 times，and 31 times the amount of solvent.Conclusion:In this study，the preferred extraction process is stable and feasible.

Acalyphaastralis；Total Flavonoids；Central Composite Design；Response Surface Methodology；Extraction Process

2015-03-17

贵州省教育厅自然科学研究基金项目(20090119)

蒙慧彤(1987-)，女，黔南民族医学高等专科学校助教，研究方向为天然药物开发应用。

魏学军(1972-)，男，黔南民族医学高等专科学校副教授，研究方向为中药与民族药质量控制研究。E-mail：qndywxj@163.com

R284

A

1673-2197(2015)15-0026-03

10.11954/ytctyy.201515010