星点设计—效应面法结合双指标优化超声提取黄芩中黄酮苷类成分

苏建春，柯华香，马 莉，赵俊霞，孙彩霞，尹蓉莉*，李 化

(1.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137；2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700； 3.首都医科大学 中医药学院，北京 100069；4.西华大学 生物工程学院，四川 成都 610039； 5.中国中医科学院 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700)



星点设计—效应面法结合双指标优化超声提取黄芩中黄酮苷类成分

苏建春1，2，柯华香2，4，马 莉3，赵俊霞1，孙彩霞1，尹蓉莉1*，李 化2,5*

(1.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137；2.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700； 3.首都医科大学 中医药学院，北京 100069；4.西华大学 生物工程学院，四川 成都 610039； 5.中国中医科学院 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700)

目的：采用星点设计—效应面法优化黄芩中黄酮苷类成分的提取工艺。方法：采用UPLC法测定黄芩苷及汉黄芩苷含量，以二者的总评“归一值(OD)”为因变量，乙醇浓度、提取时间、料液比为自变量，对结果进行多元线性回归和二项式方程拟合，采用效应面法优化提取工艺，并进行预测分析。结果：最佳提取工艺为58%乙醇，超声提取45min，料液比为1∶40，OD预测值(0.997)与验证值(0.991)的偏差小于1%。结论：星点设计—效应面法优选的黄芩中黄酮苷类成分的超声提取工艺简便，模型预测性良好，可为探讨黄芩中苷类成分提取工艺的研究提供参考。

黄芩；黄芩苷；汉黄芩苷；星点设计—效应面法；超声提取

黄芩是常用大宗中药材，为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi.的干燥根，在我国药用历史悠久，历代本草均有记载。其性苦、味寒，归肺、胆、脾、大肠、小肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等作用[1-2]。黄芩中主要有效成分为黄酮类化合物，包括黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素等[3]。其中黄芩苷和汉黄芩苷是黄芩中主要的黄酮苷类成分，二者含量占黄芩中总黄酮含量的60%以上，是衡量黄芩质量的重要指标成分。现代药理研究发现黄芩苷具有抗微生物、抗变态反应、降压、镇静、利胆、保肝和解痉等药理作用[4]。汉黄芩苷具有抗炎、抗血栓、抗肿瘤等生物活性[5]。

黄芩中黄酮类成分的提取工艺设计常采取正交设计法或均匀设计法优化[6-7]，但这两种方法是建立在线性数学模型基础上的工艺优选，精度欠佳。星点设计法采用非线性数学模型进行拟合，复相关系数较高，并在中心点进行重复性实验，提高了实验精度，预测值更接近真实值，且操作简单，实验次数少。以往的研究多选择黄芩苷作为评价指标开展黄芩中黄酮最佳提取工艺的优化，忽视了汉黄芩苷作为一个含量较高且活性较强的苷类成分，也是影响黄芩质量的重要指标之一。迄今为止，尚未见到黄酮苷双指标法优化黄芩提取工艺的研究报道。鉴于此，本文采用超高效液相色谱(UPLC)法快速测定黄芩苷和汉黄芩苷含量，首次以黄芩苷和汉黄芩苷提取率双指标的总评归一值为评价指标，采用星点设计法，结合效应面法优选黄芩中黄酮苷类成分的最佳超声提取工艺，旨在优化提取工艺的同时，为探讨星点设计—效应面法应用于黄芩中黄酮苷类成分提取工艺的可行性提供实验支持。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters ACQUITY H-Class UPLCTM超高效液相色谱仪(包括四元高压梯度泵，真空脱气机，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器，Empower Ⅱ色谱工作站)；2004 MP6 型半微量电子显示天平(德国Sartorius公司)；Scout Pro 型电子天平(美国Ohaus公司)；KQ-100DE 型医用数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司，Milli-Q 型超纯水制备仪(法国Millipore公司)。

1.2 试药

对照品黄芩苷(批号E-0050，纯度≥98%)，汉黄芩苷(批号E-0664，纯度≥98%)购自上海同田生物技术股份有限公司。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯；超纯水由Milli-Q 纯水机制备。黄芩药材采自河北省滦平县，经成都中医药大学尹蓉莉教授鉴定为唇形科植物黄芩S.baicalensisGeorgi.的干燥根。

2 方法与结果

2.1 黄芩苷和汉黄芩苷UPLC含量测定方法学建立

2.1.1 对照品溶液制备 取适量黄芩苷、汉黄芩苷对照品，加20%乙腈配制成质量浓度分别为64.80μg·mL-1和31.00μg·mL-1的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取黄芩粉末过40目筛，称取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中,加入50%乙醇50mL，超声提取，放冷，过滤，稀释，定容，取稀释液过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.1.3 UPLC色谱条件 Aquity BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱：0～0.5min(82%A)，0.5～2min(82%A～80%A)，2～6min(80%A～70%A)，6～8min(70%A)，8～10min(70%A～40%A)，10～12min(40%A)；柱温：40℃；流速：0.4mL/min；检测波长：280nm；进样体积：1μL。在上述色谱条件下，对照品及黄芩供试品溶液UPLC色谱见图1。

图1 黄芩苷对照品溶液(A)、汉黄芩苷对照品溶液(B)、黄芩样品溶液(C)UPLC图谱

2.1.4 线性关系考察 分别取“2.1.1”项中对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0μL进样，按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标，进样量(X，μg)为横坐标进行回归，绘制标准曲线。得回归方程，黄芩苷Y=8.632×106X-3.08×104(r=0.999 9)，汉黄芩苷Y=8.194×106X-7.99×103(r=0.999 9)。黄芩苷、汉黄芩苷的线性范围分别为25.92～389.00ng，12.40～186.00ng。计算最低检测限(LOD)和定量限(LOQ)，黄芩苷、汉黄芩苷的LOD分别为1.30ng·mL-1，1.55ng·mL-1(S/N=3)，LOQ分别为3.88ng·mL-1，4.65 ng·mL-1(S/N=10)。

2.1.5 精密度试验 取“2.1.2”项下同一供试品溶液在上述色谱条件，连续进样6 次，结果显示黄芩苷、汉黄芩苷峰面积的RSD分别为0.82%、0.11%。表明该方法精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取“2.1.2”项下同一供试品溶液按上述色谱条件分别在0、2、4、6、8、24h进样分析，黄芩苷、汉黄芩苷峰面积的RSD 分别为0.69%、0.32%。表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取黄芩粉末约1.0 g，共6份，精密称定，按“2.1.2”项下供试品溶液制备方法制样，在上述色谱条件分别进样，测定黄芩苷和汉黄芩苷的质量分数。结果显示，黄芩苷、汉黄芩苷质量分数的RSD 分别为1.95%、1.47%。表明该方法重复性良好。

2.1.8 回收率试验 取已知含量的黄芩粉末6份，每份约0.05g，精密称定，分别按样品中各成分含量的100%加入黄芩苷、汉黄芩苷对照品溶液，按“2.1.2”项下制备方法制备供试品溶液,进样分析，计算两种成分的回收率。结果显示，两种成分的平均回收率在101.04%～102.98%之间(RSD<4%)(见表1)。表明采用UPLC 测定黄芩苷、汉黄芩苷含量的方法准确性良好。

表1 两种黄酮苷类成分加样回收率试验结果 (n = 6)

2.2 星点设计—响应面法优化乙醇超声提取条件

2.2.1 实验设计及结果 通过单因素实验考察超声功率、乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比、提取次数对提取工艺的影响，发现提取温度对黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷含量影响较小，结合预实验结果将提取温度固定为40℃。因提取次数为非连续变量，回归处理较困难，结合预实验结果，固定提取次数为1次，超声功率40kHz。综上所述，本试验采用星点设计方法，选取乙醇浓度X1、提取时间X2、料液比X3为考察因素。根据星点设计的原理，每因素设5个水平，用代码值-α、-1、0、1、+1、+α表示(三因素星点设计的α=1.732)。因素水平见表2,实验安排及结果见表3。

表2 星点试验因素水平

表3 黄芩中黄芩苷及汉黄芩苷提取工艺星点试验安排及结果

注：15～20号为重复试验，结果用平均值表示。

2.2.2 数据处理 多指标的数据处理参照文献报道的总评归一法[8]。分别测定黄芩苷、汉黄芩苷两个指标，根据Hassan法将每个指标进行“归一值”处理，求各指标“归一值”的几何均数，即为总评“归一值”(Overall Desirability,OD)。

dimax=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin) ,OD=(d1d2……dk)1/k(k为指标数)。

2.2.3 效应面法优选工艺条件 因变量曲面图是三维图，只能表达两个自变量的函数，因此固定三个自变量之一为中值，以拟合的目标函数为数学模型，应用Design-Expert8.0.6.1统计软件绘制因变量三维图(见图2-图4)。由图2、图3可知，乙醇浓度是影响黄芩黄酮苷类成分提取的主要因素，且黄芩苷和汉黄芩苷提取率OD值随乙醇浓度的增大而增加，但增大到一定浓度时，继续增加乙醇浓度OD值有所下降，说明在一定范围内乙醇浓度的增大有利于黄芩黄酮苷类成分的提取，可当乙醇浓度继续增大，极性降低，提取率反而降低。由图4可知，随提取时间延长、料液比增加黄芩黄酮苷类成分提取率增加，但增加趋势不明显，说明提取时间、料液比对黄芩黄酮苷类成分提取影响较小。

图2 提取时间与乙醇浓度对OD值影响的三维图

通过Design-Expert进行最佳提取条件分析，以黄芩苷和汉黄芩苷OD值为考察指标，确定了黄芩中黄酮苷类超声提取的最佳工艺条件：乙醇浓度为57.89%，提取时间为44.93min，料液比为39.54∶1。考虑到实际情况，将各因素条件进行微调，最终确定黄芩中苷类成分的最佳提取工艺条件：乙醇浓度为58%，超声时间为45min，料液比为1∶40，超声提取1次，提取温度为40℃。

图3 料液比与乙醇浓度对OD值影响的三维图

图4 料液比与提取时间对OD值影响的三维图

2.2.4 验证试验 按最佳工艺进行3次验证试验，黄芩苷、汉黄芩苷含量的实测OD值分别为1.000、0.989、0.991，平均OD值为0.991，与预测OD值0.997的偏差为0.639%，表明所建立的数学模型预测良好，且该工艺条件的重复性也较好。

3 讨论

在多指标工艺筛选的试验设计中，指标间往往相互影响，对某一项指标有利的条件可能不利于另一指标，最终选择条件往往依据这些指标的综合效应。本试验以黄芩苷含量、汉黄芩苷含量为基础，根据文献报道换算为总评归一值(OD)并成功建立数学模型进行优化与数学分析，能充分、全面地反映提取工艺对黄芩中黄酮苷类成分提取的影响。

星点设计是国外常用的一种实验设计方法，国内在优化中药提取工艺方面也有应用[9-10]，本文采用星点设计—效应面法对超声提取黄芩中黄酮苷类成分的工艺进行了探讨。由实验结果可知，星点设计的理论值与实验值相差较小，采用非线性拟合模型接近客观事实，通过效应面三维图观察因素对指标的影响直观、方便，且实验精度高,预测性更好。实验结果表明星点设计—响应面分析法为优化中药有效成分提取工艺提供了有效的工具。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：282-283.

[2] 宋扬文，陈忻.中药黄芩药理作用的研究进展[J].中国中医药科技，2010,17(4):375-377.

[3] 杨娟，傅军鹏.黄芩活性成分及药效研究近况[J].实用医药杂志，2004,21(3):271-273.

[4] 张建春，张华，施瑛，等.黄芩苷研究近况[J].时珍国医国药，2005,16(3):247-249.

[5] YANG YZ,TANG YZ,LIU YH.Wogonoside?displays anti-inflammatory effects through modulating inflammatory mediator expression using RAW264.7 cells[J].J Ethnopharmacol,2013,148(1):271-276

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[7] 李展，高微微，林文卫，等.均匀设计法优化黄芩提取工艺[J].中草药，2001,32(7):606-607.

[8] 吴伟，崔光华，陆彬. 实验设计中多指标的优化: 星点设计和总评“归一值”的应用[J].中国药学杂志，2000,35(8):530-533.

[9] LI CP,WANG LL,JIN ZS,et al.Study on the extraction technique of poly-methoxyflavonoids from Citrus peels by using response surface methodology[J].Adv Mater,2012,24(8)：544-547.

[10] 梁晋如，张新新，朱砂等.星点设计—响应效应面法优化山茱萸总苷的提取及纯化工艺[J].药物分析杂志，2013,33(6):1059-1066.

(责任编辑：魏 晓)

Optimization of Ultrasonic Extraction Technology of Flavonoid Glycosides in Scutellaria Baicalensis by the Combination of CCD-RSM and a Two-indicator Model

Su Jianchun1,2，Ke Huaxiang2,4， Ma Li3，Zhao Junxia1，Sun Caixia1，Yin Rongli1*，Li Hua2,5*

(1.Chengdu college of TCM，Sichuan，Chengdu 611137，China；2.Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China；3.School of Traditional Chinese Medicine, Capital Medical University，Beijing 100069，China；4.Bio-Engineering of College of Xihua University，Sichuan，Chengdu 610039，China;5.State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China)

Objective:To optimize ultrasonic extraction Technology of baicalin and wogonoside in Scutellaria baicalensis by central composite design-reponse surface method(CCD-RSM).Methods:The contents of baicalin and wogonoside were determined by Ultra performance liquid chromatography (UPLC).Independent variables were ethanol concentration, liquid-solid ratio and extraction time, the dependent variable was the overall desirability of extraction rate of baicalin and wogonoside. Linear or no-linear mathematic models were established to estimate the relationship between independent and dependent variables. Response surface methodology was used to optimize the process of extraction. Prediction was carried out through comparing the observed and predicted values.Results:The optimum extraction technology was as following: The extraction time was 45min with solvent to solid ratios (v/w) of 40:1, and the extraction solvent was 58% ethanol at the extraction temperature of 40℃. The deviation between the observed and predicted values was small (P<0.01).Conclusion:This optimized extraction technology was stable and feasible with high predictability.This method can be provided reference for exploring the flavonoid glycosides in Scutellaria baicalensis.

Scutellaria Baicalensis;Baicalin；Wogonoside;Central Composite Design-reponse Surface Methodology;Ultrasonic Extraction

2014-11-03

国家自然科学基金项目(81202903)；科技部中医药行业科研专项(201407003)；北京市属高等学校高层次人才引进与培养计划项目(CIT&TCD201304179);国家药典委员会科研课题(“中药材品种限制产地和生长年限的研究和制定”)

苏建春(1987-)，女，满族，成都中医药大学硕士研究生，研究方向为中药新剂型、新制剂、新技术研究以及中药复方质量评价与物质基础。

尹蓉莉(1952-)，女，成都中医药大学教授，研究方向为中药新剂型、新制剂、新技术。E-mail：yinronglili@163.com 李化(1976-)，女，博士，中国中医科学院副研究员，研究方向为中药及其复方的质量评价与药效物质基础。E-mail：lihua621@hotmail.com

R284

A

1673-2197(2015)07-0032-04

10.11954/ytctyy.201507015