银杏叶提取物对大鼠主动脉粥样斑块血管内皮生长因子的影响

丰 飞,金伟东

(1.江苏大学附属医院,江苏 镇江 212001；2.南通大学,江苏 南通 226001)



银杏叶提取物对大鼠主动脉粥样斑块血管内皮生长因子的影响

丰 飞1,金伟东2

(1.江苏大学附属医院,江苏 镇江 212001；2.南通大学,江苏 南通 226001)

目的：探讨银杏叶提取物对大鼠动脉粥样斑块中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法：将48只SD大鼠随机分为四组：正常对照组大鼠12只；另建立动脉粥样硬化大鼠模型36只，分为三组，每组12只:分为银杏叶提取物组、辛伐他汀组、未干预组。干预4周后分别取胸主动脉组织，进行VEGF免疫组织化学检查，再将所取主动脉组织进行VEGF的RT-PCR及Western-blot蛋白印迹分析。结果：正常对照组无VEGF表达,银杏叶提取物组、辛伐他汀组VEGF表达明显低于未干预组。银杏叶提取物组和辛伐他汀组VEGF相对吸光度值显著低于未干预组(P<0.05) 。结论：银杏叶提取物可降低大鼠动脉粥样硬化斑块组织中VEGF表达，从而起到保护血管内皮、稳定粥样斑块的作用。

血管内皮生长因子；银杏叶提取物；动脉粥样硬化

动脉粥样硬化斑块形成与破裂所导致的急性心血管事件严重危害人类生命健康。据现有研究：血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)对动脉粥样硬化斑块形成机制具有重要意义[1]。他汀类药物对动脉粥样硬化作用已得到广泛认同[2]，其机制之一与该类药物能减少血管内皮生长因子表达，从而保护血管内皮，稳定斑块有关。银杏叶提取物(ginkgo biloba extracts，GBE)含有天然有效成分黄酮醇苷(flavonoids glycosidic)和萜类内酯(ginkgolide)[3]，在抗氧化、调节血脂、保护内皮细胞方面已有不少研究成果[4]。本实验使用银杏叶提取物干预大鼠动脉粥样硬化模型，并与辛伐他汀干预进行比较，探讨银杏叶提取物是否具有减少血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达，减轻和稳定动脉粥样斑块的作用及其相应的机制。

1 材料与方法

1.1 基本物品准备

1.1.1 实验动物 选择健康、成熟、8周龄雄性SD大鼠(rattus norvegicus)48只，体重为(200±20)g，由江苏大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要药物、试剂及仪器 丙基硫氧嘧啶：南通精华制药有限公司(50mg/片)。普通饲料、高脂饲料(含胆固醇、胆酸钠、猪油、白糖等)：江苏大学实验动物中心提供。维生素D3：30万U/支，上海通用药业股份有限公司。银杏叶提取物：银杏叶片(成药)，每片含有效成分黄酮醇苷9.6mg,萜类内酯2.4mg，江苏扬子江药业集团有限公司。辛伐他汀(舒降之,20mg/片)：默沙东(中国)制药有限公司。大鼠VEGF单克隆抗体：南京建成生物工程研究所。一步法RNA 聚合酶链反应试剂盒:Takara公司。721 型分光光度计:东方仪器厂。Smartscape生物显微、电泳图像处理系统:奥林巴斯Olympus。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 实验分组 48只雄性大鼠随机分成四组，每组12只：①正常对照组：普通饲料喂养；②银杏叶片组(GBE组)：高脂喂养+银杏叶片；③辛伐他汀组：高脂喂养+辛伐他汀；④未干预组：高脂喂养，不加其他干预。

1.2.2 大鼠动脉粥样硬化模型建立 参照既往研究，建立大鼠动脉粥样硬化模型[5-6]：采用维生素D3[7]30万U/kg体重腹腔注射加含3%胆固醇+0.5%胆酸钠+0.2%丙基硫氧嘧啶+10%猪油+5%白糖和81.5%普通饲料的高脂饲料喂养，并于上述饲料喂养后第7天使用球囊损伤主动脉内皮。喂养8周，Doppler超声验证主动脉斑块形成。

1.2.3 药物干预 银杏叶片组每日喂服银杏叶片0.5片/(kg·d)(每片含黄酮醇苷9.6mg,萜类内酯2.4mg)；辛伐他汀组每日喂服辛伐他汀5.0mg/(kg·d)；高脂饮食组,生理盐水灌胃。所有动物均自由饮水,最终取得完整资料者进入分析,共45只,银杏叶片组11只,辛伐他汀组11只,未干预组11只,正常对照组12只。

1.2.4 标本收集与处理 所有大鼠用氯胺酮麻醉后，打开胸腔，剪取主动脉弓至膈肌以上主动脉1.5～2cm，将胸主动脉标本立即投入10%甲醛液固定，在病理人员协助下制作主动脉切片，HE染色。同时取新鲜的血管组织标本,利用大鼠VEGF单克隆抗体行VEGF免疫组织化学检查,以PBS代替VEGF单克隆抗体作为阴性对照,请两位病理学专业人员在事先未告知实验情况的前提下对各组免疫组织化学染色最显著区域VEGF信号强度进行分级:阴性、弱阳性和强阳性。逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)步骤：组织总RNA一步法提取。

Western-Blot蛋白印迹分析：制作组织匀浆液，并加入蛋白裂解液,各样本4℃高速离心20min,定量后各取等量样本行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上,封闭液封闭1h。将膜与一抗共同孵育90min,加入辣根过氧化物酶标记的二抗共同孵育45min,加等体积增强发光化学试剂孵育1min。在暗室将膜在感光胶片上曝光并用相纸显影洗像,调整曝光时间直至显影出电泳带,采用生物电泳图像处理系统对免疫复合物进行分析。以β-actin 作为内参照,以各组产物吸光度值与β-actin 吸光度值的比值作为各组产物相对吸光度值。

2 结果

2.1 病理学检查结果

苏木精-伊红染色(HE)结果：正常对照组(图1)大鼠主动脉光镜下见内皮细胞完整，内膜光滑,未见脂纹,内膜、中膜和外膜分界清楚;中膜主要由呈同心排列的弹性纤维膜组成，基质内可见有环形的平滑肌细胞;外膜较薄，为疏松结缔组织，内含少量平滑肌细胞。未干预组(图2)内膜增厚 ,透明变性,粥样斑块隆起,斑块内可见脂质沉积和大量泡沫细胞,中膜弹力纤维和胶原纤维形态较紊乱。银杏叶提取物组(图3)、辛伐他汀组(图4)均未见明显粥样斑块，内膜增生程度低于未干预组,中膜弹力纤维和胶原纤维形态优于未干预组。

图1 正常对照组(300×) 图2 未干预组(300×)

图3 银杏叶提取物组(300×) 图4 辛伐他汀组(300×)

2.2 免疫组织化学结果

正常对照组主动脉则未见VEGF 阳性表达(图5)。未干预组(图6)粥样斑块区可见密集分布的染成棕色不规则斑点的VEGF阳性表达信号,银杏叶提取物组(图7)、辛伐他汀组(图8)粥样斑块不明显，VEGF阳性表达信号的棕黄色斑点显微镜下观察已不明显。银杏叶提取物组、辛伐他汀组与未干预组比较，有显著差异(P<0.001)，VEGF信号强度弱于未干预租；而银杏叶提取物组与辛伐他汀组比较无显著差异(P>0.05)。见表1。

图5 正常对照组(300×) 图6 未干预组(300×)

2.3 逆转录-聚合酶链反应结果

正常对照组无扩增产物表达,银杏叶提取物组、辛伐他汀组可见扩增产物模糊条带,未干预组则呈现强亮度条带,扩增产物大小为380 bp (图9) 。未干预组条带亮度明显高于银杏叶提取物组、辛伐他汀组。银杏叶提取物组、辛伐他汀组吸光度值分别与未干预组比较，差异显著(P<0.001),银杏叶提取物组、辛伐他汀组相对吸光度值相比较无显著差异(P>0.05)。见表2。

图7 银杏叶提取物组(300×) 图8 辛伐他汀组(300×)

组别强阳性弱阳性阴性合计GBE组∗010111辛伐他汀组∗07411未干预组110011正常对照组001212合计11171745

注：与未干预组比较，*P<0.001。

图9 逆转录-聚合酶链反应分析结果

2.4 Western-Blot蛋白印迹分析结果

正常对照组无VEGF表达,银杏叶提取物组、辛伐他汀组及未干预组均可见不同密度VEGF表达(图10) ：未干预组VEGF信号强度明显高于银杏叶提取物组和辛伐他汀组。银杏叶提取物组、辛伐他汀组吸光度值分别与未干预组比较，差异显著(P<0.001),银杏叶提取物组、辛伐他汀组相对吸光度值比较无显著差异(P>0.05)。见表2。

图10 Westen Blot 蛋白印迹分析结果

表2 各组血管内皮生长因子逆转录-聚合酶链反应和Western-Blot产物相对吸光度值变化 (±s)

注：与未干预组比较，*P<0.001。

3 讨论

血管内皮生长因子(VEGF) 是目前所发现的唯一特异性促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子,在血管新生过程中具有重要意义,抑制VEGF 在动脉粥样斑块中的表达可一定程度地控制斑块生长进程[8]。

VEGF在血管发育、重构和成熟过程中起重要的调控作用：VEGF可通过炎症浸润和新生血管形成等机制促进动脉粥样硬化损伤的发展，与斑块的不稳定性有密切关系[9]。Chen等[10]研究证实，在粥样斑块平滑肌及巨噬细胞中，都有VEGF的强表达。VEGF阳性细胞数目与内膜血管化程度正相关，且VEGF阳性细胞分布与新生血管分布高度一致，即主要位于斑块肩部和纤维帽部。在血流剪切力的作用下，斑块的上述部分易发生破裂，导致急性心脑血管事件的发生。进一步研究斑块损伤区域VEGF，将为稳定粥样斑块，预防心脑血管疾病的发生提供新的研究方向。

目前关于他汀类药物对粥样斑块稳定性影响的研究很多[11],银杏叶提取物防治动脉粥样硬化中的机制也不再局限于抗氧化，调节血脂[12]。本研究结果发现：银杏叶提取物和辛伐他汀均能够明显降低VEGF 在大鼠主动脉粥样斑块中的表达,逆转录-聚合酶链反应和Western-Blot 蛋白印迹分析从mRNA 水平和蛋白质水平进一步证实了上述结果。可见银杏叶提取物和辛伐他汀可通过降低VEGF 在粥样斑块中的表达，在一定程度上抑制血管新生,这与他汀抑制血管新生的报道结果一致[13]。

本实验验证了银杏叶提取物对粥样斑块内VEGF表达的下调作用，而VEGF水平的下降能够起到稳定粥样斑块，防止斑块破裂作用。近年来国内外大量研究发现，银杏叶提取物可通过多种作用机制抑制动脉粥样硬化的发生与发展[14]。银杏叶提取物作为众多治疗动脉粥样硬化的天然药物中疗效较为突出的药物，值得进一步研究。

[1] 章燕幸，陈怀红.血管内皮生长因子与动脉粥样硬化[J].国际脑血管病杂志，2006，14(6)：452-455.

[2] 尚可，袁展群.辛伐他汀对动脉粥样硬化大鼠的干预作用及机制[D].南昌：南昌大学， 2008.

[3] 唐慧勤，王乃平，张玉萌.中药抗动脉粥样硬化作用机制的研究进展[J].中国药物应用与监测，2006，3(3)：14.

[4] 徐艳芬，张丽娟，宋新波.银杏叶提取物研究进展[J].药物评价研究，2010，33(6):452-456.

[5] 杨军珂，郭延松，吴宗贵，等.一种大鼠动脉粥样硬化斑块模型的建立[J].中国心血管杂志，2004，9(5)：353-356.

[6] 郭延松，吴宗贵，杨军珂，等. 三种大鼠动脉粥样硬化模型复制方法的比较[J].中国动脉硬化杂志，2003，11(5)：465-469.

[7] 刘磊，焦向英，张炜芳，等.高脂饲料及维生素D3联合应用建立大鼠动脉粥样硬化模型[J].山西医科大学学报，2005，36(6)：681-684.

[8] ALAN NT, KEVIN GP, MICHAEL HS, et al.Neovascularization in atherectomy specimens from patients with unstable angina:Implications for pathogenesis of untable angina[J].American Heart Journal,1998, 135(1):10-14.

[9] 赵仙先，朱家麟，张宝仁，等.血管内皮生长因子在动脉粥样硬化斑块中的表达[J].第二军医大学学报，1999，20(9):669-671.

[10] CHEN YX, NAKASHIMA Y, TANAKA K,et al. Immunohistochemical expression of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor in atherosclerotic intimas of human coronary arteries[J].Arteoscler Thromb Vasc Bio,1999,19(1):131-139.

[11] 张敏,陈桢月,陆国平，等.辛伐他汀对内皮细胞株ECV-2304 细胞分化抗原40 诱导表达的影响[J].中国动脉硬化杂志，2003,11(3):234-237.

[12] 牟冷丽，寇俊萍，朱丹妮，等.银杏叶提取物的化学成分及其抗氧化活性[J].中国天然药物，2008，6(1)：26-28.

[13] VINCENT L, SORIA C, MIRSHAHI F,et al. Cerivastatin, an inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase,inhibits endothelial cell proliferation induced by angiogenic factors in vitro and angiogenesis in in vivo models[J].Arteoscler Thromb and Vasc Bio,2002,22(4):623-629.

[14] 万冬宇，黄维义.银杏叶提取物抗动脉粥样硬化作用机制的研究进展[J].心血管病学进展，2010,31(1)：131-133.

(责任编辑：魏 晓)

Effects of Ginkgo Biloba Extracts on VEGF of Atherosclerotic Aortic Plague of Rat

Feng Fei1，Jin Weidong2

(1.Jiangsu University Affiliated Hospital , Zhenjian 212001,China; 2.Nantong University, Nantong 226001, China)

Objective:The aim of this study is to demonstrate whether GBE has the effect that decrease VEGF in the plaque of atherosclerotic rat.Methods:Duplication of atherosclerotic rat , 36 atherosclerotic rats were randomly divided into 3 groups:12 intervened by GBE,12 intervened by simvastatin and 12 without drug intervention for another 4 weeks.Then the rats were executed to take specimens from aorta HE staining and immunohistochemistry assay to observe the expression of VEGF. At the same time ,specimens were taken into RT-PCR and Western-blot.Results:No VEGF was expressed in normol group. Non-intervention group had stronger density expressing VEGF than the drug intervention groups .The relative absorbency of GBE group and simvastatin group is lower than that of non intervention group(P<0.05).Conclusion:GBE can reduce the expression of VEGF so as to protect the blood vessel endothelium cell and stabilify the plaque.

Vascular Endothelial Growth Factor；Ginkgo Biloba Extracts；Atherosclerosis

2014-11-07

丰飞(1976-)，男，江苏大学附属医院主治医师，研究方向为急性心血管病的治疗。

R285.5

A

1673-2197(2015)07-0005-03

10.11954/ytctyy.201507003