正交设计多指标综合评分优化鳖甲微波灭菌工艺

万 露，闵红燕，肖云芝，张文骞，申宝德，韩 晋*，袁海龙*

(1.江西中医药大学，江西 南昌 330000；2.中国人民解放军第三〇二医院，北京 100039；3.成都中医药大学，四川 成都 611137)



正交设计多指标综合评分优化鳖甲微波灭菌工艺

万 露1,2，闵红燕1，肖云芝3，张文骞2，申宝德2，韩 晋2*，袁海龙2*

(1.江西中医药大学，江西 南昌 330000；2.中国人民解放军第三〇二医院，北京 100039；3.成都中医药大学，四川 成都 611137)

目的：优选鳖甲的微波灭菌工艺。方法：以药材含湿率、灭菌时间、灭菌功率为考察因素，以灭菌率和鳖甲抗肝纤维化作用(人肝星状细胞LX-2生长抑制率)为评价指标，采用正交设计多指标综合评分法优化微波灭菌鳖甲的工艺参数。结果：最佳微波灭菌工艺参数：灭菌时间为6min，药材含湿率为20%，灭菌功率为4 000W。结论：正交设计多指标综合评分法可用于鳖甲微波灭菌工艺的参数优化，该方法简便可行，且灭菌效率高，对鳖甲抗肝纤维作用无影响。

鳖甲；微波灭菌；正交设计；多指标综合评分

复方鳖甲软肝片是我国治疗慢性肝炎纤维化、早期肝硬化的首选药[1]，主要由鳖甲、赤芍、当归等11味药组成，其中鳖甲为原材料粉碎直接入药。国家食品药品监督管理总局(CFDA)明确规定：中药原粉入药品种必须选择合适的方式进行灭菌[2]，药材的灭菌工艺是影响制剂质量的重要因素。

不当的灭菌方法会破坏中药材中的有效成分而降低其疗效，也可使药材产生一些有害物质或残留灭菌介质从而损害机体，也可导致活性成分迁移。因此以原粉入药的中药的灭菌方法与一般药材不同，应有严格的工艺要求。常用中药灭菌方法包括湿热灭菌、紫外线灭菌、环氧乙烷灭菌法、滤过除菌、臭氧灭菌、干热灭菌法、Co60辐射灭菌等，但均存在一定不足[3]。据文献报道，微波灭菌技术具有良好的灭菌效果，其穿透力强、时间短、效率高，对药材的成分不造成影响[4-5]。CFDA在进行中药新药审评时[6]，对微波灭菌技术的效果给予了肯定，认为其是理想的中药材灭菌方法。

本研究采用微波灭菌法处理复方鳖甲软肝片中以原粉入药的鳖甲，为避免单一指标进行工艺优化时产生偏差且兼顾微波灭菌的效果与药材质量，拟以灭菌率和肝星状细胞LX-2的生长抑制率为考察指标，采用正交设计多指标综合评分法优化微波灭菌工艺，筛选最佳灭菌工艺，现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

YHD-4HMY型微波杀菌机(北京亿慧达微波设备有限公司，工作频率为2 450MHz，微波功率最大可调6 000W)；BAS-124S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；XDS-1B倒置生物显微镜(北京京瑞天下科技有限公司)；Forma Series II水套CO2培养箱(Thermo Fisher)；Multiskan GO全波长酶标仪(Thermo Scientific)。

1.2 试药

鳖甲药材(中国人民解放军第三〇二医院提供，经中国人民解放军第三〇二医院袁海龙研究员鉴定为鳖甲)；pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(北京三药科技开发公司，批号：140306)；细菌营养琼脂培养基(北京三药科技开发公司，批号：140212)；霉菌玫瑰红钠琼脂培养基(北京三药科技开发公司，批号：140228)；水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

胎牛血清(美国HyClone公司，批号：DPEO167)；二苯基四氮唑蓝(MTT，批号：1325B38)、二甲基亚砜(DMSO，批号：20130505324)均购自美国Amresco公司；LX-2肝星状细胞(北京协和细胞资源中心)。

2 方法与结果

2.1 因素水平确定

在微波干燥灭菌的实践经验和前期单因素试验基础上，选取灭菌功率(A)、灭菌时间(B)和药材含湿度(C)为考察因素，每个因素设定3个水平，具体因素水平见表1。

表1 鳖甲微波灭菌工艺正交实验因素水平

2.2 药材处理

称取粉碎的鳖甲3份，每份0.20kg，分别以10%、20%、30%纯化水拌润均匀，取样，检测细菌数。按照L9(34)正交表安排试验，微波真空干燥箱温度设定为60℃，润湿鳖甲药材后以一定的厚度(1～3cm)均匀平铺于微波真空干燥箱内部托盘上，按照预定的灭菌功率和时间对鳖甲进行灭菌处理，灭菌结束后，立即将药材装入已灭菌的容器中备用。

2.3 微生物限度检查[8]

参照《中国药典》2010 年版一部附录ⅩⅢ中的微生物限度检查法，取灭菌前后药材各10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液溶解至100mL，作为1∶10供试液。取1∶10供试液1mL加0.9%无菌氯化钠溶液至10mL，作为1∶100供试液。采用稀释法(0.5mL/皿)检查(附录ⅩⅢ C)细菌数，采用常规法检查酵母菌数，采用常规法检查控制菌数。

灭菌率(%)=(灭菌前细菌数-灭菌后细菌数)/灭菌前细菌数×100%。

2.4 MTT法测定鳖甲抗纤维化作用

2.4.1 细胞系及其培养条件 LX-2肝星状细胞系在含有20%胎牛血清、1.0×103U/L青霉素、100mg/L链霉素以及必需氨基酸和葡萄糖等营养物质的培养液中，于37℃、5%CO2环境下进行常规培养，实验均在细胞生长对数期时进行。

2.4.2 供试品溶液配制 精密称取灭菌前及不同灭菌条件下处理的鳖甲各5g，分别置于50mL具塞锥形瓶中，加75%乙醇25mL，称重，超声提取60min，取出放冷后再称重，补足减少的重量，摇匀，离心10min(7 000r/min)。提取液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，冷冻干燥，供抗肝纤维化试验使用。

2.4.3 鳖甲药材提取液细胞抑制率测定 前期实验[8]确定了样品最佳添加量为35%浓度。取对数生长期LX-2肝星状细胞，采用胰酶常规消化成单细胞悬液，接种至96孔板中(每孔约5×104细胞)，孔板四周以无菌PBS填充以防止边缘效应。细胞置于96孔板中贴壁24h后(每孔200μL)[9]，将其分成10组分别给予35%浓度灭菌前鳖甲药粉溶液、灭菌后鳖甲药粉溶液(含0.1%DMSO的培养基溶液)，并设置8个空白对照孔(加入含相应浓度生理盐水的DMEM培养基)和8个调零孔，细胞在37℃、5%CO2条件下培养48h后，加入5mg/mL MTT溶液20μL，继续培养4h后，小心吸取培养液，每孔加入DMSO溶液200μL，摇床低速振荡10min后，采用酶联免疫检测仪测定各孔在490nm处的吸光度值，实验重复3次。结果见表2，方差分析见表3。

抑制率=(A0-A1) / A0，其中A0为阴性对照组吸光度值，A1为药物组吸光度值。

2.5 正交试验结果

按照L9(34)正交设计表进行试验，分别测定各条件下的灭菌率和细胞抑制率。

采用综合加权评分法[10-11]，结合该工艺的特点和相关文献，权衡各指标对处方的影响，设定指标灭菌率(X/%)和 细胞抑制率(Y/%)的权重系数分别为0.6、0.4 ，根据各指标的权重，计算多属性综合评价指标，对正交试验数据进行综合分析，综合评分=0.6X/98.1+0.4Y/50.97，结果见表2、表3。

直观分析表明，以综合评分为标准，在所选因素水平范围内，各因素作用主次顺序为B>C>A，方差分析表明，B(灭菌时间)为主要影响因素，具有显著性(P<0.05)，最终确定最佳提取工艺为A2B2C2，即灭菌功率为4 000W，灭菌时间为6min，药材含湿率为20%。

2.6 最佳工艺条件验证

按照最佳工艺条件灭菌3批鳖甲药材，测得鳖甲中各指标成分含量，并计算综合评分，结果见表4，与预测值接近，其RSD为0.863%。鳖甲中霉菌及酵母菌数每1g<100cfu，微生物控制菌，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均未检出，证明该方法稳定可行。

表2 微波灭菌工艺L9(34)正交试验设计及结果

表3 鳖甲微波灭菌工艺正交试验方差分析

表4 鳖甲最佳微波灭菌工艺验证结果 (%)

3 讨论

据文献报道，微波的穿透深度为 3～5cm[14]，本研究亦表明，当药材平铺厚度为1～3cm时，粉碎粒径大小对其灭菌效果影响不大，说明微波可穿透至介质和药材的深部，可使药材表里一致的均匀受热，且灭菌时间越长，灭菌率越高。由于鳖甲中的活性成分为蛋白质及多肽类，其分子结构特殊，温度的升高可导致多肽主链氨基酸降解以及侧链氨基酸残基变化[15]，大大影响药材质量。因此，本实验选择对微波灭菌效果影响最大的三个因素进行考察，筛选出符合实际工艺的两个评价指标，以灭菌率评价灭菌效果，以人肝星状细胞LX-2生长抑制率评价鳖甲抗肝纤维化作用。本研究采用多指标综合加权评分法对实验结果进行分析，较单一指标更为科学，且对各指标数据进行必要的标准化处理，保证了评价指标的全面性，使灭菌工艺的优化更为合理。

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(责任编辑：尹晨茹)

Optimization of the Microwave Sterilization Technology of Carapax Trionycis by Orthogonal Design with Multi-index Comprehensive Evaluation Method

Wan Lu1,2,Min Hongyan1,Xiao Yunzhi3,Zhang Wenqian2,Sheng Baode2,Han Jin2*,Yuan Hailong2*

(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Jiangxi 330000,China;2.302 Military Hospital of China,Beijing 100039,China；3.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective:To optimize the microwave sterilization technology of Carapax Trionycis.Methods:Orthogonal design was carried out to achieve the best microwave sterilization technology of C.Trionycis by the multi-index comprehensive evaluation method with herbs moisture content,sterilization time and microwave power as investigation factors,and sterilization rate and anti-hepatic fibrosis efficacy (the LX-2 hepatic stellate cell proliferation inhibition rate) as indexes.Results:The best sterilization technology was as follows: herbs moisture content 20%,sterilization time 6 min and microwave power 4 000W.Conclusion:It is simple and feasible that using orthogonal design with multi-index comprehensive evaluation method to optimize the microwave sterilization technology of C.Trionycis.This method not only has high sterilization efficiency,but also has no effect on C.Trionycis anti-hepatic fibrosis efficacy.

Carapax Trionycis;Microwave Sterilization;Orthogonal Design;Multi-index Comprehensive Evaluation

2014-10-11

国家新药创制重大专项(2011ZX09201-201-14)；军队医疗机构制剂标准提高科研专项(13ZJZ12，13ZJZ12-5)

万露(1989- )，女，江西中医药大学硕士研究生，研究方向为中药新制剂、新剂型、新技术。

袁海龙，男，博士，中国人民解放军第三〇二医院研究员，博士生导师，研究方向为中药新型给药系统。E-mail: yhlpharm@126.com；韩晋，女，中国人民解放军第三〇二医院主任药师，博士生导师，研究方向为中药剂型与工程技术。E-mail: hanjin302emba@163.com

R284;R954

A

1673-2197(2015)06-0026-03

10.11954/ytctyy.201506011