日本乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

李 建，廖园园，秦红刚，刘 洁，朱 薇，漆世华，韩 兴，徐 松，舒银辉，谢红玲

（武汉中博生物股份有限公司，武汉430070）

日本乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及初步应用

李 建，廖园园，秦红刚，刘 洁，朱 薇，漆世华，韩 兴，徐 松，舒银辉，谢红玲∗

（武汉中博生物股份有限公司，武汉430070）

采用日本乙型脑炎病毒单克隆抗体预包被酶标板，将纯化的日本乙型脑炎病毒（JEV）作为检测用抗原，利用包被捕获法建立了用于检测猪乙型脑炎抗体的间接ELISA法。采用建立的ELISA法对50份已知阴性血清样本检测，临界OD450nm值为0.343，ELISA与IFA对200份血清进行平行检测，总符合率为92.9%，与商品化的同类国产试剂盒的符合率为95%。与其他常见的猪病毒阳性血清抗体无交叉反应，2～8℃保存12个月稳定。研制的ELISA抗体检测试剂盒为临床JEV血清抗体检测及其疫苗的免疫效果评价提供了技术手段。

日本乙型脑炎病毒；间接ELISA；试剂盒；抗体

猪乙型脑炎病是由乙型脑炎病毒引起的严重威胁人畜健康的一种中枢神经系统传染病［1］。在动物中，猪是本病的主要传染源，该病在大多数养猪场呈地方流行，是引起母猪繁殖障碍的疾病之一。该病对猪致死率不高，但能引起怀孕母猪流产、死胎或木乃伊胎，也能引起公猪睾丸急性炎症反应或不育［2］。目前已经建立多种检测JEV的方法［3］，包括病毒分离、分子生物学诊断技术、酶联免疫吸附试验等，这些方法在病原检测或抗体检测中各有特点，在该病的诊断中发挥了重要的作用。如何在此基础上开发纯度高、性能稳定的检测试剂以及更容易在生产实践中推广应用的快速检测方法，仍然是今后乙脑病毒疾病防治的一个重点。为建立一种敏感、特异、快速的乙型脑炎病毒抗体检测方法，使JEV疫苗的效果评价更快捷、准确和方便，本研究利用捕获包被和间接ELISA法研制了一种检测JEV抗体的试剂盒，并初步应用于猪场JEV疫苗免疫之后的效果评价。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 仓鼠肾细胞（BHK－21）购自invitrogen，SP2／0细胞系购自中检所；JEV为本公司保存；FITC标记羊抗小鼠IgG（Thermo公司）、HRP标记羊抗小鼠（Thermo公司）、DMEM培养基（Hyclone公司）、HAT（Sigma公司）、HT（Sigma公司）、单抗亚类鉴定试剂盒（洛阳赛尔维公司）；猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒（武汉科前动物生物制品有限公司）；超速离心机（Beckman）；酶标仪；洗板机。

1.2 抗原的制备 将乙型脑炎病毒（JEV）按照0.01MOI接种到BHK－21细胞中，37℃培养72～96 h，收获细胞培养物，经蔗糖密度梯度离心［4］纯化后进行电镜检测。

1.3 动物免疫 将一定量的JEV与等体积的弗氏完全佐剂混合并完全乳化后，小鼠腹股沟两侧靠近淋巴结区和颈部皮下多点免疫，每次免疫间隔21 d。

1.4 细胞融合 按照常规方法［5］无菌采取小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞按10∶1比例混合，用PEG进行融合，将融合之后的细胞加入铺好饲养细胞的96孔板中。

1.5 单抗的筛选 利用间接ELISA、IFA和IPMA法对所培养的杂交瘤上清进行检测，有限稀释法对检测阳性的杂交瘤细胞进行至少三次以上的克隆直至阳性率为100%为止。

1.6 单克隆抗体的亚类测定 按照洛阳赛尔维公司单抗亚类试剂盒说明书进行单克隆抗体亚类的测定。

1.7 腹水的生产及其纯化 选择12周龄以上的雌性BALB／c小鼠，腹腔注射单克隆杂交瘤细胞，7 d之后收取小鼠腹水，采用盐析法纯化腹水。

1.8 杂交瘤细胞的染色体分析 按常规方法［6］对杂交瘤细胞的染色体进行分析，于高倍显微镜下观察，每份样本应计数100个中期完整的核细胞，记录染色体数目的分布。

1.9 ELSIA试剂盒的制备 按照方阵滴定方法［7］优化ELISA反应条件，确定日本乙脑病毒单克隆抗体和抗原的包被浓度。对一抗和二抗的最佳稀释浓度和反应时间进行优化。

1.9.1 判定标准的确定 选用间接免疫荧光（IFA）检测JEV抗体阴性猪血清50份，经ELISA检测结果进行统计学分析，统计其平均值和标准差，计算阴阳性值的临界点。

1.9.2 特异性检测 取同一批次的ELISA试剂盒对200份猪血清进行检测，观察结果，并与IFA结果进行比较。

1.9.3 灵敏度检测 空白对照液：0.01 mol／L，pH＝7.4的PBS。梯度浓度的样品液：用0.01 mol／L，pH＝7.4的稀释的抗体，浓度分别为2、1、0.5、0.25、0.125 μg／mL梯度浓度。

1.9.4 稳定性检测 空白对照液：0.01 mol／L，pH＝7.4的PBS。样品液：用0.01 mol／L的PBS稀释的浓度分别为0.5、1 μg／mL抗体。同一批次的ELISA试剂盒分别放4℃和37℃，1周和2周后对上述对照液和样品液进行检测，观察结果。

1.10 ELISA抗体试剂盒与商品化同类试剂盒的比较试验 用自制ELISA抗体检测试剂盒与从武汉科前动物生物制品有限公司购买的猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒进行比较。

1.11 ELISA抗体检测试剂盒在临床上的应用 从武汉地区某猪场采集327份猪血清，进行ELISA抗体水平检测。其中屠宰猪血清182份，45日龄猪血清80份，35日龄猪血清 40份，20日龄猪血清25份。

2 结果

2.1 乙型脑炎病毒的纯化 经蔗糖密度梯度离心共获得5 mg乙型脑炎病毒抗原，电镜结果可见病毒颗粒（图1）。

图1 JEV电镜图片（箭头所指为JEV病毒粒子）

2.2 单克隆抗体的筛选

2.2.1 间接免疫荧光试验（IFA） 单抗 1∶1000稀释，FITC标记的抗小鼠IgG 1∶100稀释，2株单克隆抗体均能与接种了JEV的BHK细胞发生反应，出现了绿色荧光，阴性对照未见荧光（图2）。

2.2.2 免疫过氧化物酶单层实验（IPMA） 单抗1∶1000稀释，HRP标记羊抗小鼠IgG 1∶100稀释，AEC显色，2株单克隆抗体均能与感染了JEV的BHK细胞发生反应，出现红色着染，阴性对照细胞未见阳性反应（图3）。

图2 JEV单抗的间接免疫荧光检测结果

图3 JEV单抗IPMA检测结果

2.3 单克隆抗体亚类的测定 7F1亚类是IgG2a，10H3亚类是IgG2b。

2.4 腹水效价的鉴定 杂交瘤细胞上清的效价在1∶256，OD值在1.0左右，腹水的ELISA抗体效价均在1∶106以上。

2.5 杂交瘤细胞的染色体分析 杂交瘤细胞的染色体在95～110范围内变化，平均值在98左右，该数值大于脾细胞染色体数的2倍，小于脾细胞与骨髓瘤细胞染色体数目之和，表明该杂交瘤细胞确实为脾细胞与骨髓瘤细胞融合的产物。

2.6 ELISA试剂盒检测试验

2.6.1 判定标准的确定 ELISA检测血清的平均值为0.157，标准差为0.062，按样品临界值＝阳性样品平均值＋3×标准差计算，其临界值为0.343，将样品OD450nm值≥0.343者判为阳性，介于 0.343～0.281为可疑，小于0.281为阴性。

2.6.2 ELISA试剂盒特异性试验 ELISA检测结果显示：200份猪血清标本有127份阳性，73份阴性，同时用IFA检测猪血清标本，118份阳性，82份阴性，二者总符合率为92.9%（表1）。

表1 ELISA与IFA抗体检测结果比较表

2.6.3 ELISA试剂盒灵敏度试验 灵敏度结果显示，阴性对照和 0.125 μg／mL无阳性反应，0.25 μg／mL开始有阳性反应，并且随着浓度的升高颜色逐渐加深。

2.6.4 ELISA试剂盒稳定性试验 0.5、1 μg／mL纯化抗体稳定性检测结果见表2。

表2 ELISA稳定性检测结果表

2.7 ELISA抗体试剂盒与商品化同类试剂盒的比较试验 通过使用自制的ELISA抗体检测试剂盒与购买的商品化的试剂盒相比较，阴阳性对照完全成立的情况下，自制ELISA抗体试剂盒在检测样品的敏感性方面要高于商品化的试剂盒（表3）。

表3 自制试剂盒与商品化试剂盒比较试验结果表

2.8 试剂盒在临床上的检测 用已经建立的ELISA法对327份待检猪血清进行JEV抗体的检测结果（表4）表明，阳性头数为59，阳性率为18%。

表4 不同日龄猪乙型脑炎ELISA抗体检测结果

3 讨论

在单克隆抗体制备的实验中，抗原的纯度至关重要，它直接决定着后期能否顺利筛选到所需要的杂交瘤细胞株，因此，用蔗糖密度梯度离心的方法来纯化日本乙型脑炎病毒，此方法除了对病毒损伤小，还能够获得较高纯度的抗原。在单抗检测环节，除了用常规的间接ELISA方法之外，还用IFA和IPMA来检测筛选到的杂交瘤细胞株，这样得到的单抗更加具有说服力。

自制乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒，用单克隆抗体包被捕获JEV抗原，具有提高捕获抗原的纯度和检测的特异性及敏感性的优点。目前市场上有不少厂家销售乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒，商品化的试剂盒主要采用原核系统表达日本脑炎病毒中的某一个蛋白作为包被抗原，结合血清中的抗体检测的方法。原核表达的蛋白没有经过修饰，与天然病毒的构象相差较大，与抗体结合能力不如天然病毒能力强，因此，自制试剂盒的敏感性和特异性比较高。自制试剂盒与间接免疫荧光检测JEV抗体及商品化的ELISA抗体检测试剂盒的符合率分别为92.9%和93.8%，适合猪场血清抗体检测，对于JEV流行病学的调查具有重要的意义［8］。下一步，应用本研究制备的单克隆抗体所生产的乙脑病毒抗体检测试剂盒，申报产品，作为PCR等猪乙型脑炎病毒临床快速诊断方法的补充和验证。

［1］汤德元，郭万柱.日本脑炎病毒及其疫苗的研究［J］.中国兽医学报，2005，25（2）：217－221.

［2］Nga P T，del Carmen Parquet，M Cuong V D，et al.Shift in Japanese encephalitis virus（JEV）genotype circulating in northern Vietnam：implications for frequent introductions of JEV from Southeast Asia to East Asia［J］.J Gen Virol，2004，85（Pt6）：1625－1631.

［3］YUN S I，Kim S Y，Choi W Y，et al.Molecular characterization of the full－length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39［J］.Virus Res，2003，96（1／2）：129－140.

［4］杜念兴.兽医免疫学［M］.第2版.北京：中国农业出版社，1997.

［5］刘秀梵.单克隆抗体在农业上的应用［M］.合肥：安徽科学技术出版社，1994：32－36.

［6］章谷生，容秉培.单克隆抗体在医学上的应用［M］.上海：上海科学技术出版社，1987.

［7］曹雪涛.精编免疫学实验指南［M］.北京：科学出版社，2009.

［8］祖立闯，沈志强.乙型脑炎病毒间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的研制及其应用［J］.养猪，2011，（5）：98－102.

（编 辑：侯向辉）

Development and Primary Application of ELISA Kit for the Detection of Antibody against Japanese Encephalitis Virus

LI Jian，LIAO Yuan－yuan，QING Hong－gang，LIU Jie，ZHU Wei，QI Shi－hua，HAN Xing，XU Song，SHU Yin－hui，XIE Hong－ling∗
（Wuhan Chopper Biological Co Ltd，Wuhan430070，China）

With capture coating method，indirect ELISA method for detecting Japanese encephlitis antibody was established using Japanese encephlitis virus monoclonal antibody to pre－coat ELISA plate and using purified Japanese encephlitis as detecting antigen.The ELISA was optimized and the kit was developed for checking the immune results of JEV vaccines.In comparison with inderect immunofluorescence（IFA），there was 92.9% coincidence between the ELISA and IFA based on detection of 200 serum samples.With the commercialization of the same kind of domestic kits，there was 95%coincidence.There was no cross reactions for the positive serums of other common Japanese encephlitis antibodies.The kit was stable kept up to 12 months at 2～8℃.The kit was used for clinical laboratory and detection of serum antibody.

Japanese encephalitis virus；indirect ELISA；kits；antibody

2014－09－15

A

1002－1280（2015）01－0010－04

S852.65

李 建，从事动物病毒体外诊断试剂的研究工作。

谢红玲。E－mail：13419546263＠163.com