β－受体激动剂质谱裂解特征研究

应永飞朱聪英周 炜屈 健陆春波汪以真

（1.浙江大学动物科学学院，杭州310058；2.浙江省畜产品质量安全检测中心，杭州310020）

β－受体激动剂质谱裂解特征研究

应永飞1，2，朱聪英2，周 炜2，屈 健2，陆春波2，汪以真1

（1.浙江大学动物科学学院，杭州310058；2.浙江省畜产品质量安全检测中心，杭州310020）

以克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇为代表，阐明了β－受体激动剂在正离子软电离模式下的裂解机理。采用AB SCIEX 5500 QTRAP三重四级杆电喷雾质谱仪，运用IDA－EPI技术，对β－受体激动剂类化合物裂解规律进行研究解析。结果表明，在ESI正电离模式下β－受体激动剂容易获得H＋而形成［M＋H］＋准分子离子峰，该结构易丢失水分子（H2O，继而与氨基结构相连的碳氮键（－C－N－）发生断裂，形成与苯环共轭的（Ph－CH＝CH－NH＋－）离子结构。本研究为同类化合物的结构解析提供了可靠依据以及跟踪新型β－受体激动剂提供了有力手段。

β－受体激动剂；质谱裂解；液相色谱－串联质谱法

β－受体激动剂是一种化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇胺类化合物，因该类物质可以加快畜禽生长，降低胴体脂肪含量，提高瘦肉率，曾被作为促生长剂在饲料和饮水中添加使用［1］。由于该类化合物易在动物组织中形成残留，人们食用后曾多次发生中毒事件，所以我国已全面禁止该类化合物作为生长促进剂在动物养殖中使用［2］。但是，由于经济利益的驱使，目前仍被少数不法分子非法添加到饲料中，且近年来新型药物不断出现［2］，因此需要对β－受体激动剂进行有效的检测和监控。

质谱图是化合物结构的直观反映［3］，质谱分析

具有检测速度快、灵敏度高和样品耗费少等优点，已成为复杂体系中痕量组分分析的一种重要方法［4］。 虽然有关动物尿液［5－6］、牛奶［7］、动物组织［8－9］β－受体激动剂检测的文献已有大量报道，但是，针对其质谱裂解机理研究的文献鲜见报导，且以Q－TOF等高分辨质谱检测方法为主［10－11］。本研究采用AB SCIEX 5500 QTRAP三重四级杆－线性离子阱电喷雾质谱仪，通过调节源内碰撞裂解（源内CID）能量，继而利用三重四级杆－线性离子阱实现准 MS／MS／MS［12］，对克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇3种化合物的裂解行为进行了考察，分别代表苯胺型、苯酚型和水杨酸型三种结构，研究它们在正离子软电离状态下的裂解行为。本研究为同类化合物的结构解析提供了可靠依据，为跟踪新型β－受体激动剂提供了有力手段，具有较强的理论意义和实用价值（图1）。

图1 三种β－受体激动剂化学结构式

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 1290N 高效液相色谱仪（Agilent公司，美国），AB SCIEX 5500 QTRAP三重四级杆－线性离子阱电喷雾质谱仪（ABSCIEX公司，美国），配电喷雾离子源（ESI）；Hamilton 1000 μL注射器 （Hamilton 公 司，美 国）；MS3minishaker旋涡混匀器（IKA公司，德国）；XS－205电子天平（METTLER公司，瑞士）。

1.2 标准物质与试剂 克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准品（Dr.Ehrenstorfer公司，德国）；甲醇、乙腈、甲酸，均为色谱纯（Merck公司，美国）；实验用水为Milli－Q超纯水。

1.3 质谱条件与方法 离子源：电喷雾离子源；监测模式：正离子扫描模式；离子源电压为5500 V；辅助加热气温度为500℃；气帘气流速为40 L／h；脱溶剂气流速为中等；雾化气和辅助气均为45 L／h；质量全扫描范围为m／z50～450。试验方法包括：进样方式为注射器直接进样，流速为5 μL／min；碰撞气为N2。同时利用源内CID对准分子离子［M＋H］＋进行MS2分析，然后再对产生的碎片离子进一步进行四极杆－线性离子阱CID（MS3）分析，结合IDA－EPI扫描，获得相应的子离子质谱图，进行待测物的裂解特征研究。

1.4 样品制备 分别称取克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇标准物质适量，用甲醇配制成浓度均为1.0 mg／mL标准储备液。准确量取1.0 mL储备液分别置于100 mL容量瓶中，用甲醇配制成浓度均为10 μg／mL标准中间液。分别取20 μL标准中间液，用0.1%甲酸溶液／甲醇（9∶1，V／V）稀释至1 mL，三种β－受体激动剂标准工作液的最终浓度为200 ng／mL，用注射器直接进样分析。

2 结果

2.1 克伦特罗的裂解特征解析 由图2可以发现，克伦特罗的准分子离子峰［M＋H］＋为m／z277、279、281，其丰度比约为9∶6∶1，这与每个分子中含有2个Cl原子的结构一致，与文献报道吻合［3］。因m／z277灵敏度最高，作为母离子对其进行子离子扫描CID（MS2），结果产生了m／z259、203、168和132等碎片离子。其中，m／z259对应于［M＋H－18］＋，通过比较两离子之间质量差值，确定脱去的碎片（m／z18）为H2O分子。由m／z259碎片离子经结构重排后，失去（2－甲基丙烯）得到m／z203的特征碎片。而m／z168与m／z203质量数相差35，这恰好为Cl原子的质量，故可确认它是脱去氯自由基（Cl·）后形成的碎片，m／z168进一步丢失m／z36（HCl）形成碎片离子m／z132。进一步对主要子离子m／z203进行源内CID（MS3）分析，其准三级质谱图见图3，结果生成了m／z168和132碎片，与MS2结果一致，其可能裂解途径见图4。

图2 三种β－受体激动剂［M＋H］＋离子的ESI－MS2图谱

图3 三种β－受体激动剂［M＋H］＋离子的ESI－MS3图谱

图4 克伦特罗［M＋H］＋离子可能的ESI－MS2裂解途径

2.2 沙丁胺醇的裂解特征解析 由图2可以发现，沙丁胺醇的准分子离子峰［M＋H］＋为m／z240，作为母离子对其进行子离子扫描CID（MS2），结果产生了m／z222、204、166和148等碎片离子。其中，m／z222相应于［M＋H－18］＋，通过比较两离子之间质量差值，确定脱去的碎片（m／z18）为H2O分子，因沙丁胺醇的水杨酸结构，苯甲醇结构再脱去一个H2O分子（m／z18），得到碎片离子m／z204。由m／z222碎片离子经结构重排后，失去2－甲基丙烯（m／z56）得到m／z166的特征碎片。而m／z166与再脱去一个H2O分子（m／z18）得到碎片离子m／z148。进一步对主要子离子m／z222进行源内CID（MS3）分析，其准三级质谱图见图3，结果生成了m／z204、166和148碎片，与MS2结果一致，其可能裂解途径见图5。相对于苯胺型和苯酚型的β－受体激动剂，水杨酸型结构的沙丁胺醇的裂解过程比较典型，也更具有代表性。

2.3 莱克多巴胺的裂解特征解析 由图2可以发现，莱克多巴胺的准分子离子峰［M＋H］＋为m／z302，作为母离子对其进行子离子扫描CID（MS2），结果产生了m／z284、164、136和121、107、91等碎片离子。通过比较两离子之间质量差值，m／z284相应于［M＋H－18］＋，确定脱去的碎片（m／z18）为H2O分子。采用源内进一步对主要子离子m／z284、164、136进行源内CID（MS3）分析，其准三级质谱图见图3，结果发现m／z284→m／z164→m／z121具有相关性，而m／z284不能直接产生m／z136、107等碎片离子，故这些离子可能由准分子离子峰［M＋H］＋m／z302直接产生。

由于莱克多巴胺氨基左右结构基本对称，故而碎片离子较为丰富，为结构鉴定提供了足够信息，其可能裂解途径见图6。

图5 沙丁胺醇［M＋H］＋离子可能的ESI－MS2裂解途径

图6 莱克多巴胺［M＋H］＋离子可能的ESI－MS2裂解途径

3 讨论

电喷雾电离是一种软电离技术，其优点在于容易得到相对分子质量的信息，但软电离技术所生成的准分子离子过剩的内能较少，往往产生的碎片离子很有限。而三重四级杆质量分析器的工作原理是先测得准分子离子，然后选中该离子通过适当碰撞诱导解离能量将其打碎，从而获得更多的结构信息，因此，电喷雾结合三重四级杆质量分析器是结构分析的理想选择。

3.1 一级全扫描质谱分析 采用电喷雾离子源，在正离子监测模式下对三种β－受体激动剂进行质谱分析。在一级全扫描质谱分析中，克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇均检测到信号很强的准分子离子峰［M＋H］＋（均为基峰）。推测这可能与化合物本身结构有关，此类化合物含有氨基（－NH）结构，易与质子结合形成季铵盐的稳定结构，故加合峰响应值很高。

3.2 质谱数据分析及裂解规律研究 为了研究分子结构与裂解途径之间的关系，分别对三种β－受体激动剂的［M＋H］＋准分子离子峰进行CID分析，从低到高调节适宜的碰撞能量，使其［M＋H］＋峰产生稳定的碎片离子，探讨该类化合物的质谱裂解途径。

由于β－受体激动剂均属于苯乙醇胺类化合物，具有基本骨架相同、结构类似的特点，但苯环上及氨基连接官能团有差异，所以它们的ESI－MS／MS行为应存在着相似性和差异性。通过比较化合物的结构信息和质谱信息，发现它们在软电离状态下均存在丢失中性分子H2O的裂解途径。同时利用源内CID对［M＋H］＋离子进行MS2分析，然后对产生的碎片离子进一步进行四极杆－线性离子阱CID（MS3）分析，获得相应的子离子质谱图。

3.3 电喷雾电离的裂解方式 电喷雾电离作为一种软电离技术，通常易于丢失中性小分子，进而生成稳定性较高的离子，本试验也证明了这一点。因β－受体激动剂都含有苯乙醇胺的母体结构，所以在ESI正电离模式下容易获得H＋而形成［M＋H］＋准分子离子峰，该结构易丢失H2O等中性分子，以水杨酸型的β－受体激动剂最为典型。该类化合物氨基结构相连的（－C－N－）键容易断裂，产生与苯环共轭的（Ph－CH＝CH－NH－）离子结构。这两对子离子的丰度较高，易于检测，可作为此类化合物及其衍生物定性分析中的“诊断”离子。

3.4 含氯化合物的裂解规律探讨 除克伦特罗外，克伦塞罗、氯丙那林等很多β－受体激动剂药物结构中都含有Cl原子，因此质谱图中有氯化物特征同位素峰的出现，这是由于自然界中37Cl与35Cl的天然丰度之比约为1∶3。这种特征为此类药物的定性分析和碎片归属提供了极为有用的依据。由于此类药物结构中的 Cl原子与苯环直接相联，属于芳香族氯化物，所以裂解时Cl原子以中性自由基方式异裂［13］，显示出［M＋H－Cl］＋强峰，提供了典型碎片离子。

4 结论

本实验采用AB SCIEX 5500 QTRAP三重四级杆电喷雾质谱仪，对三种代表性β－受体激动剂质谱裂解机理进行了研究，对其中可能的解离途径进行了解析。在ESI正电离模式下，β－受体激动剂容易获得H＋而形成［M＋H］＋准分子离子峰，该结构易丢失H2O等中性分子，而与氨基结构相连的（－CN－）键容易断裂，产生与苯环共轭的（Ph－CH＝CHNH＋－）离子结构。鉴于β－受体激动剂苯乙醇胺类化学结构的类似性，本研究也为其他β－受体激动剂的质谱解析提供了理论依据。

［1］应永飞，朱聪英，陈慧华，等.多壁碳纳米管分散固相萃取结合LC－MS／MS测定饲料中11种β－受体激动剂［J］.中国畜牧杂志，2013，49（9）：68－73.

［2］中华人民共和国农业部.农业部公告第1519号［S］.

［3］李 馨，王英武，顾景凯，等.三唑仑苯二氮卓类药物的电喷雾质谱裂解特征［J］.分析化学，2003，31（9）：1105－1108.

［4］郭泽琴，霍佳丽，王建华，等.β－内酰胺类抗生素质谱裂解机理研究［J］.质谱学报，2014，35（1）：45－51.

［5］Williams L D，Churchwell M I，Doerge D R.Multiresidue confir⁃mation of β－agonists in bovine retina and liver using LC－ES／MS／MS［J］.J Chromatogr B，2004，813（1／2）：35－45.

［6］Nielen M W F，Lasaroms J J P，Essers M L，et al.Multiresidue analysis of beta－agonists in bovine and porcine urine，feed and hair using liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry［J］.Anal Bioanal Chem，2008，391（1）：199－210.

［7］Li C，Wu Y L，Yang T，et al.Simultaneous determination of clenbuterol，salbutamol and ractopamine in milk by reversedphase liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution［J］.J Chromatogr A， 2010， 1217（50）：7873－7877.

［8］吴平谷，应永飞，陈慧华，等.同位素稀释结合固相萃取快速测定动物组织中 β2－兴奋剂［J］.分析化学，2007，35（3）：330－334.

［9］Zhang X Z，Gan Y R，Zhao F N.Determination of clenbuterol in pig liver by high－performance liquid chromatography with a coulometricelectrode array system［J］.Anal Chim Acta，2003，（489）：95－101.

［10］Wang X J，Zhang F，Ding F，et al.Simultaneous determination of 12 β－agonists in feeds by ultra－high－performance liquid chromatography－quadrupole－time－of－flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2013，1278：82－88.

［11］王英武，顾景凯，王 玲，等.电喷雾电离－四极杆飞行时间质谱法研究三种β2－受体激动剂的质谱裂解特征［J］.质谱学报，2004，25（2）：69－72.

［12］焦豪妍，许风国，田 媛，等.氟喹诺酮类化合物电喷雾质谱裂解规律［J］.中国抗生素杂志，2009，34（6）：344－347.

［13］陈耀祖，涂亚平.有机质谱原理及应用［M］.北京：科学出版社，2001：149－150.

（编辑：侯向辉）

Study on Mass Spectral Characteristics of β－receptor Agonists

YING Yong－fei1，2，ZHU Cong－ying2，ZHOU Wei2，QU Jian2，LU Chun－bBo2，WANG Yi－zhen1
（1.College of Animal Sciences，Zhejiang University，Hangzhou310058，China；2.Animal Products Quality Testing Centre of Zhejiang Province，Hangzhou310020，China）

To clarify pyrolysis mechanism of β－receptor agonists under positive mode，representative drugs including clenbuterol，salbutamol and ractopamine had been chosen to study with AB SCIEX 5500 QTRAP triple quadrupole mass spectrometry and IDA－EPI technology.The results showed that under ESI positive mode，βreceptor agonists were easy to form ［M＋H］＋.The structure was easy to loss neutral molecules，such as H2O.Moreover，the C－N bond connected with amino group was easy to broken and produce conjugated ion structure with benzene.This study had important theory research significance and practical value，such as providing reliable basis for other β－receptor agonists structural analysis and providing powerful means to track new β－receptor agonists.

β－receptor agonists；mass spectral characteristics；liquid chromatography－tandem mass spectrometry

2014－10－14

A

1002－1280（2015）01－0052－06

S859.83

公益性行业（农业）科研专项（201203023－4）

应永飞，博士，从事饲料安全检测研究。E－mail：yyf1001＠163.com