灵芝活性组分在小鼠体内的降糖功效研究

包 焜，陈 萍，毕云枫，王佳男，方洪帅，苗玉强

（吉林农业大学食品科学与工程学院，长春130118）

灵芝活性组分在小鼠体内的降糖功效研究

包 焜，陈 萍，毕云枫，王佳男，方洪帅，苗玉强

（吉林农业大学食品科学与工程学院，长春130118）

为了探究灵芝活性组分灵芝多肽、多糖的降血糖机理，采用四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型，经不同组分灵芝提取物灌胃连续4周后测定空腹血糖值、胰岛素浓度、肝糖原、肌糖原含量、肝脏SOD活性MDA含量。结果表明，灵芝多糖能有效增加小鼠血清胰岛素浓度（P＜0.05）；灵芝多肽和多糖可显著降低糖尿病小鼠空腹血糖含量，降糖率分别为19.1%和29.8%；显著增强小鼠肝脏SOD活性（P＜0.05，升高率分别为13.4%和19.7%；降低肝脏MDA含量（P＜0.05，且分别降低了27.8%和35.1%。

灵芝；多肽；多糖；血糖；胰岛素

近年来随着宠物食品构成以及饲喂方式的改变，犬猫糖尿病发病率也呈现出逐年上升的态势。除了传统的膳食控制和药物治疗外，辅助降糖中药活性成分治疗对糖尿病宠物的血糖调节和控制起积极作用，开发辅助治疗糖尿病的宠物食品以及中兽药有助于预防宠物糖尿病和肥胖症的发生，符合我国当前对宠物糖尿病治疗方法研究的需求。

灵芝是珍贵的药用真菌，其中，灵芝多糖是灵芝最重要的活性物质，多数研究侧重其抗癌活性等。1985年，Hikino H研究表明灵芝多糖具有降血糖作用［2］。灵芝肽是灵芝又一重要活性物质，具有一定的抗氧化、保肝护肝等活性［3－4］。 孙颉等［5］研究表明灵芝多肽的降血糖效果具有一定的持续性。本研究开展了灵芝降糖组分灵芝多肽，灵芝多糖及灵芝糖肽混合物对四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠降血糖功能的影响，拟探索其降糖机理，以期为灵芝资源的进一步利用以及促进灵芝降血糖宠物食品及中兽药的研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 灵芝粉（批号20140520），吉林健龙生物科技公司；四氧嘧啶（Sigma A7413），北京拜尔迪生物公司；盐酸二甲双胍缓释片（批号：130806），河北山姆士药业有限公司；葡萄糖测定试剂盒（批号20140201147）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（批号20140522，规格50T／48样）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（批号 20140519，规格50T／48样）、糖原测定试剂盒（批号20140530，规格50T／48样）、Brodford蛋白测定试剂盒（批号20140416，规格50T／48样），南京建成生物工程研究所；胰岛素测定试剂盒（批号20140601A），卡尔文生物科技有限公司。

1.2 主要仪器 WD－2102型自动酶标仪，北京市六一仪器厂；H－2050R离心机（大容量），长沙湘仪离心机仪器有限公司；LGJ－12冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；DY89－Ⅱ型电动玻璃匀浆机，宁波新芝生物科技股份有限公司；

1.3 药物制备 将灵芝粉与磷酸钠缓冲液（pH 7.5）以料液比为1∶10（g∶mL）进行混合，于4℃条件下浸提过夜，4000 r／min离心20 min，取上清液缓慢添加硫酸铵至85%饱和度（沉淀用于提取灵芝多糖），4℃冰箱静止过夜，5000 r／min离心40 min，沉淀用蒸馏水溶解，透析得到灵芝蛋白提取液，采用碱性蛋白酶对灵芝蛋白进行酶解，酶解条件为酶添加量为680 U／mL，pH 9.43，温度44.58℃，酶解时间为4.19 h，灵芝蛋白酶解物经分子量为10000 Da的超滤膜超滤分离后，取膜透过物，采用葡聚糖凝胶Sephadex G－25进行凝胶过滤层析，取组分二冻干，即为灵芝多肽。

将提取灵芝蛋白后余下的物质，参照文献［6］，利用传统的热水浸提法，提取灵芝多糖。

1.4 动物分组 选取18～22 g的健康昆明种小鼠，由吉林大学实验动物中心提供，雌雄各半，适应性喂养3 d后，禁食12 h。以200 mg／kg的剂量对小鼠腹腔注射四氧嘧啶生理盐水溶液。正常饲养3 d后再禁食12 h。眼眶静脉丛采血，3500 r／min离心10 min，取上清即为血清，采用葡萄糖氧化酶－过氧化物酶法，按试剂盒说明操作，测定小鼠空腹血糖值。选用空腹血糖值在11.1～26.1 mmol／L的小鼠为糖尿病模型小鼠。

取建模成功小鼠60只，每组12只，雌雄各半，分为模型对照组（灌胃生理盐水）、阳性药物组（700 mg／kg）灵芝多肽组（300 mg／kg）、灵芝多糖组（700 mg／kg）和灵芝糖肽复合组（多糖700 mg／kg＋多肽300 mg／kg）［5］另取健康昆明种小鼠12只（雌雄各半）为正常对照组（灌胃生理盐水）。按0.1 mL／10 g体重灌胃，每天1次，连续28 d。在试验的第0、1、2、3、4周，对各组小鼠眼眶静脉丛取血（取血前禁食12 h），测定空腹血糖值。

1.5 指标测定 空腹血糖值、血清胰岛素浓度、肝糖原、肌糖原、肝脏超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）以及肝脏丙二醛（Malondialdehyde，MDA）的测定均参照文献［7］，按试剂盒说明操作。

1.6 统计分析 采用IBM SPSS 20.0统计软件对数据进行统计分析，各组数据均采用单因素anova方差分析。结果用均值±标准差（±s，n＝12）表示。

2 结果与分析

2.1 灵芝降糖组分对糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影响 灵芝多糖组小鼠与模型对照组相比，血糖从第一周开始显著降低（P＜0.05），灵芝多肽组和灵芝混合组小鼠血糖从第二周开始显著降低（P＜0.05），至第四周时，灵芝多肽组、多糖组及混合组的血糖降低率分别为19.1%，29.8%和35.7%，后两者的降糖效果与阳性药物组相比差异不显著（P＞0.05）。

表1 灵芝提取物对糖尿病模型小鼠空腹血糖值的影响结果表

2.2 灵芝降糖组分对糖尿病模型小鼠胰岛素浓度的影响 与正常对照组相比，四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的血清胰岛素水平显著降低（P＜0.05）；灵芝糖肽混合物升高糖尿病小鼠血清胰岛素浓度的幅度最大，与模型对照组相比，升高了 26.9%（P＜0.05），与阳性药物组相比差异不显著（P＞0.05）；灵芝多肽组小鼠血清胰岛素浓度略有升高，但与模型对照组相比，差异不显著（P＞0.05）。

表2 灵芝提取物对糖尿病模型小鼠胰岛素浓度的影响结果表

2.3 灵芝降糖组分对糖尿病模型小鼠肝糖原、肌糖原含量的影响 与模型对照组相比，灵芝糖肽混合物组糖尿病小鼠肝糖原含量增加了13.2%（P＜0.05），而灵芝多糖组和灵芝多肽组小鼠肝糖原含量变化均不显著（P＞0.05）。与模型对照组相比，灵芝多肽、多糖及糖肽复合物均可轻度增加糖尿病小鼠肌糖原含量，但与模型对照组相比，差异不显著（P＞0.05）。

表3 灵芝提取物对糖尿病模型小鼠肝糖原、肌糖原含量的影响结果表

2.4 灵芝降糖组分对糖尿病模型小鼠肝脏SOD和MDA的影响 与正常对照组相比，四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的明糖尿病小鼠肝脏SOD活力显著降低（P＜0.05），肝脏MDA含量显著升高（P＜0.05）。与模型对照组相比，灵芝多肽组、多糖组及糖肽混合组小鼠的肝脏SOD活力分别升高了13.4%，19.7%和28.4%。（P＜0.05），且灵芝多糖组及糖肽混合组与阳性药物组相比差异不显著（P＞0.05）。与模型对照组相比，灵芝糖肽混合组小鼠肝脏MDA含量降低率最明显（P＜0.05），降低了50.6%，与阳性药物组相比差异不显著（P＞0.05）。

图1 灵芝提取物对糖尿病模型小鼠肝脏SOD和MDA的影响

3 讨论

目前发现的降血糖的机理主要为两个方面，一个是对激素水平的调节作用，另一个是对糖代谢过程中的酶活性的调节作用。氧化应激是指体内活性氧化物质的产生和抗氧化防御体系之间失衡，从而导致组织损伤的一种状态［8］。已有大量研究表明，机体的氧化应激水平和糖尿病之间关系密切［9］，氧化应激在介导胰岛细胞凋亡过程中以及对糖尿病的发生和发展起着关键性作用。

本研究主要通过检测糖尿病小鼠糖代谢过程中以及反映氧化应激水平的重要指标，来评价灵芝降糖组分的降糖效果，从而分析其降糖机理。首先，在构建糖尿病模型时需要注意，糖尿病小鼠建模后第3 d，血糖值太高会导致小鼠的死亡，太低则糖尿病症状不明显，均视为建模失败。有关研究表明，小鼠空腹血糖值在11.1～26.1 mmol／L为理想模型［6］。本试验所选糖尿病小鼠模型初始血糖值均在11.1～26.1 mmol／L之间，糖尿病症状明显且死亡率低。试验研究发现灵芝多肽，多糖及糖肽混合物均能有效的降低糖尿病小鼠的空腹血糖，且灵芝多糖及灵芝糖肽复合物的降血糖效果要与阳性药物盐酸二甲双胍相当。试验结果表明，灵芝多肽对糖尿病小鼠有显著地降血糖作用，这与孙颉等［5］的试验结论相一致，但孙颉等并未对其降糖机理进行深入研究，而据试验结果分析，灵芝多肽可以降低糖尿病小鼠血糖的原因主要有两方面，本试验前期已经进行了灵芝多肽对体外α－葡萄糖苷酶抑制活性的研究，灵芝多肽可以通过抑制小肠中α－葡萄糖苷酶的活性，减少血液中葡萄糖来源，从而降低血糖含量；其次，根据本研究试验中SOD和MDA的数据分析可知，灵芝多肽可以通过增强肝脏细胞中SOD的活性，减少有害物质MDA的生成，增强机体抗氧化能力，保护糖尿病小鼠胰岛B细胞免受自由基和活性氧的进一步破坏，使胰岛素的合成和分泌有所升高，从而降低血糖含量。而灵芝多糖除可以增强糖尿病小鼠肝脏SOD活力，降低MDA的含量（P＜0.05），增强糖尿病小鼠机体抗氧化能力之外，可能主要通过改善或修复受损伤的胰岛B细胞，使血清胰岛素的合成和分泌升高，进而起到降低血糖的作用，张玲芝等［10］在灵芝多糖降血糖的机理研究中也得出了相同的结论。试验结果同样表明，灵芝糖肽混合物组在降低糖尿病小鼠血糖，升高血清胰岛素浓度以及提高小鼠肝糖原含量方面，效果均优于灵芝多肽组及灵芝多糖组，且效果接近于盐酸二甲双胍阳性药物组，说明灵芝多肽和多糖在降低糖尿病小鼠血糖方面具有一定的协同作用［11］，这与孙颉等［5］的试验结论不一致，可能是因为孙颉等采用的是茶多糖与灵芝多肽复合降糖，而本试验采用的是灵芝多糖与灵芝多肽复合降糖的原因。

灵芝多肽，多糖及糖肽混合物均能有效持续的降低糖尿病小鼠的空腹血糖，提高机体抗氧化能力，减少氧化应激导致的机体损伤，改善了糖尿病的发生发展，因此，本研究对灵芝降血糖功能性食品以及治疗宠物糖尿病中兽药的开发具有良好的理论参考和应用价值。

［1］Canadian Diabetes Association 2008 clinical practice guidelines for the prevention and management of diabetes in Canada［M］.Canadian Diabetes Association，2008.

［2］Hikino H，Konno C，Mirin Y，et al.Isolation and Hypoglycemic Activity of Ganoderans A and B［J］.Planta medica，1985，51（04）：339－340.

［3］Shi Y，Sun J，He H，et al.Hepatoprotective effects of Ganoderma lucidum peptides against d－galactosamine－induced liver injury in mice［J］.Journal of Ethnopharmacology，2008，117（3）：415－419.

［4］黄生权，敖 宏，曾凡逵，等.灵芝蛋白酶解产物分析及其抗氧化活性的研究［J］.现代食品科技，2013，29（1）：24－28.

［5］孙 颉，何 慧.灵芝肽对实验性糖尿病小鼠的治疗作用［J］.食品科学，2002，23（11）：133－135.

［6］Chen X P，Wang W X，Li S B，et al.Optimization of ultrasound－assisted extraction of Lingzhi polysaccharides using response surface methodology and its inhibitory effect on cervical cancer cells［J］.Carbohydrate Polymers，2010，80（3）：944－948.

［7］郭元日.发酵人参对四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的疗效学研究［D］.延边大学，2013：6－8.

［8］Anwar M M，Meki A R.Oxidative stress in streptozotocin－induced diabetic rats：effects of garlicoil and melatonin［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part A：Molecular and Integrative Physiology，2003，135（4）：539－547.

［9］林 龙，常建波，孙煜煊.孔石莼多糖降血糖作用研究［J］.食品科技，2012（6）：224－227.

［10］张玲芝，冯 磊.灵芝多糖降血糖的机理探讨［J］.福建医药杂志，2004，26（3）：137－140.

［11］滕宝松.灵芝有效降糖组分的筛选及降血糖机理研究［D］.复旦大学，2012：27.

（编 辑：陈 希）

Hypoglycemic Effect of Ganoderma Lucidum Active Component

BAO Kun，CHEN Ping，BI Yun－feng，WANG Jia－nan，FANG Hong－shuai，MIAO Yu－qiang
（Food Science and Engineering，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China）

Test is designed to explore the mechanism of Ganoderma lucidum hypoglycemic active components，Ganoderma lucidum peptides and polysaccharide.The diabetic mice model was established by using alloxan.The diabetic mice were orally given with different Ganoderma lucidum extracts for four weeks.The fasting blood glucose（FBG）concentrations，insulin concentrations，content of liver glycogen and muscle glycogen，hepatic SOD and MDA level were measured.The results showed that Ganoderma lucidum polysaccharide significantly increased the insulin concentrations of the diabetic mice（P＜0.05）.Ganoderma lucidum peptides and polysaccharide all significantly decreased the FBG of diabetic mice by 19.1%and 29.8%，respectively（P＜0.05）.Improved the activity of hepatic SOD by 13.4%，19.7%，respectively（P＜0.05）.Decreased the level of hepatic MDA significantly by 27.8%，35.1%，respectively（P＜0.05）.

Ganoderma lucidum；peptides；polysaccharide；FBG；insulin

2014－10－18

A

1002－1280（2015）01－0029－04

S853.74

包 焜，硕士研究生，从事食品科学方向研究。E－mail：157092463＠qq.com