腺嘌呤致慢性肾功能衰竭大鼠CTGF、FN的实验研究

★ 闫渊 马晓燕 崔峥 (辽宁中医药大学附属医院中医内科教研室 沈阳110032)

慢性肾衰竭(chronic renal failure CRF)为各种慢性肾脏病持续进展的共同结局。它是以代谢产物潴留，水、电解质及酸碱代谢失衡和全身各系统症状为表现的一种临床综合征［1］。腺嘌呤大鼠肾衰模型虽然早已用于CRF的研究当中，但是仍很少有从结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)和纤维蛋白(fibronectin FN)的角度来探讨其作用机理，而CTGF、FN及其相关研究已经成为目前防治脏器纤维化的热点。因此如以CTGF和FN为切入点，观察其在CRF大鼠中的表达分布，将为肾纤维化的病理研究和防治提供新的思路。

1 材料与方法

1．1 主要药物及试剂 腺嘌呤25g/瓶，美国Amresco公司生产;兔抗大鼠CTGF、FN、SABC法免疫组化试剂盒，购自武汉博士德。

1．2 动物模型建立及分组 SPF级SD雄性大鼠40只(体重180±20g)，由辽宁长生生物技术有限公司提供，动物合格证号:SCXK(辽)2010－0001。按体重层次随机抽取20只为正常组，余下大鼠为模型组。各组大鼠适应性饲养1周后，模型组按每只大鼠200mg/(kg·d)的腺嘌呤灌胃［2］，每日1次，正常组以等量NaCl溶液灌胃，连续灌胃4周，在造模期间因灌胃手法不当，误伤肺组织而导致正常组大鼠死亡1只，腺嘌呤组大鼠死亡2只。

1．3 标本收集 各组大鼠分别于第4周后处死，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取血化验肾功能;全自动生化分析仪检测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN);取左侧部分肾组织用4%多聚甲醛固定，其余肾组织分别置于PC管中，液氮保存。肾组织经4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(厚度为4～5μm)后常规HE染色，OLMPUS显微镜观察各组肾组织病理变化并拍照。

1．4 免疫组织化学法检测CTGF、FN的表达 免疫组化SABC法染色，一抗用兔抗大鼠CTGF、FN抗体，二抗用相应羊抗鼠抗体(工作浓度按产品说明书配制为1∶100)染色呈棕褐色或棕黄色者为阳性染色，OLMPUS显微镜观察每张切片并随机选取5个视野，用捷达801图像分析系统进行图像分析，检测视野内免疫阳性细胞的平均灰度值，测得组织细胞平均灰度值愈小，其蛋白水平愈高。

1．5 统计学方法 计量资料用(¯x±s)表示，应用SPSS17．0软件中的t检验进行统计分析。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 两组大鼠肾组织HE染色结果 在10倍镜下观察两组大鼠肾组织的病理学改变，正常组的肾脏皮质，肾小球结构、形态、大小，血管球与肾小球囊腔的比例正常，髓质，近端小管与远端小管的管壁薄厚、管腔大小正常，无炎性细胞浸润。模型组的肾脏皮质，肾小球结构、形态、大小不正常，血管球萎缩、肾小球囊腔变大，比例失调，近端小管与远端小管的管壁薄厚不匀、肿胀，管腔大小不一，有大量的炎性细胞浸润。见图1。

表1 各组大鼠SCr、BUN检测结果(¯x±s)

表2 各组大鼠CTGF、FN水平的比较(¯x±s)

图1 各组大鼠肾组织HE染色

图2 各组大鼠CTGF表达

图3 各组大鼠FN表达

2．2 各组实验大鼠血清Scr及BUN的比较 在造模后4周，腺嘌呤组的SCr和BUN明显升高，与正常组比较腺嘌呤组的SCr、BUN差异有统计学意义(P＜0．01)。详见表1。

2．3 两组大鼠CTGF、FN的表达 造模4周后，正常组CTGF、FN表达不明显，而腺嘌呤组肾小管上皮细胞胞浆和胞核中CTGF、FN表达增加(P＜0.01)。细胞中有棕黄色颗粒者为阳性细胞表达(见表2，图2、3)。

3 讨论

用腺嘌呤灌胃的大鼠肾衰竭模型，我国主要用于CRF及肾间质纤维化的研究。周小舟等［3］通过观察灌胃21d后大鼠的SCr、BUN、血浆总蛋白、肾比重、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶等指标提出腺嘌呤大鼠CRF的机理可能为其代谢产物尿酸结晶刺激、阻塞而损伤肾小管及间质导致其功能减退;耿静［4］通过复制郑平东教授的慢性肾衰模型，并通过测定SCr、BUN及24h尿蛋白定量和显微镜观察肾组织的病理变化，进一步证实腺嘌呤按体重灌胃给药可达到CRF的造模要求并且结果稳定、可控，为临床常用一些温补肾阳之品治疗CRF患者提供了理论依据。因此本实验采用腺嘌呤肾病模型，造模4周后模型组SCr、BUN明显升高，差异有统计学意义(P＜0．01)，肉眼可见似人类的“大白肾”，由此可知腺嘌呤已成功复制出CRF大鼠肾衰竭模型。现研究表明CTGF作为转化生长因子TGF－β1的下游反应元件，在肾纤维化中起到很大的作用，尤其是在原位杂交的结果中发现，正常肾组织中仅有少量CTGFmRNA表达。在一些伴有细胞增殖、基质沉积的肾小球炎症及小管间质损伤疾病中，CTGFmRNA表达明显增高，更加证明了CTGF在肾纤维化病程中的作用［5－6］。FN是一种具有较强细胞粘附活性的高分子糖蛋白，在正常肾组织中主要分布于肾小球系膜区，是肾组织内的固有成分。在肾硬化的研究中，国内外学者皆发现ECM的各种成分中以FN的反应最为迅速而持久，先于胶原W、胶原V和层粘连蛋白。如张月娥［7］的研究表明，在肾小球炎症早期FN迅速出现，中、后期亦维持高水平，后期W型胶原才明显增多，提示FN是一种始动因素，局部FN和胶原的堆积及其强烈的化学趋化性，是导致成纤维细胞、肾小球系膜细胞、内皮细胞增殖及肾小球硬化形成的重要基础。FN的增多是胶原蛋白沉积的必要条件，FN的持续增加，加快了肾脏纤维化和硬化的速度。本实验中腺嘌呤组的CTGF、FN的表达明显增加(P＜0．01)，提示腺嘌呤灌胃制作的大鼠肾衰模型是通过CTGF和FN的表达而实现，从而为中医药治疗CRF提供新靶点。

［1］陈灏珠，钟南山，陆再英．内科学［M］．北京:人民卫生出版社，2014:524－532．

［2］郑平东，朱燕俐，丁名城，等．用腺嘌呤制作慢性肾功能衰竭动物模型［J］．中华肾脏病杂志，1989，5(6):342－344．

［3］周小舟．腺嘌呤所致大鼠慢性肾功能衰竭的机理研究［J］．基础医学与临床，1997，2(17):54－57．

［4］耿静．腺嘌呤所致大鼠慢性肾功能衰竭的实验研究［J］．河南中医学院学报，2008，3(23):24－25．

［5］MurphyM，GodsonC，CanonS，et al．Suppression subtractive hybridization identifies high glucose levels as a stimulus for expression of connective tissue growth factor and other genes in human mesangial Cells［J］．Biol Chem，1999，274:5 830．

［6］WahabNA，Yevdokimova N，Weston BS，et al．Role of connective tissue growth Factor in the pathogensis of diabetic nephropathy［J］．Bioehem J，2001，359:77．

［7］张月娥．纤维连接蛋白在肾小球硬化过程中的演变情况观察［J］．中华病理杂志，1987，16(1):36．