高效液相色谱法检测小麦粉感染害虫后尿酸含量的研究

袁 园，刘凤杰，王争艳，鲁玉杰

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

小麦粉是人们生活的必需品，是生产馒头、面包等面食的主要原料.随着经济的发展和人民生活水平的提高，提高小麦粉及其制品的质量已成为一种客观要求[1].在小麦粉的进出口贸易中，小麦粉中昆虫的检测成为一项重要的判断小麦粉质量好坏的指标.小麦粉中常见的虫害种类大致分为两类：一类是鞘翅目的赤拟谷盗、锯谷盗和土耳其扁谷盗；一类是真螨目的椭圆食粉螨[2].尿酸是昆虫氮代谢的最终产物，尿酸及盐类几乎都不溶于水，排泄时不需要伴随水的流失[3].测定小麦粉中尿酸含量可以检验小麦粉中是否有害虫的发生以及发生的程度.利用磷钨酸还原法测定出小麦粉中尿酸含量与感染的虫卵量呈正相关关系，但该方法操作步骤复杂，不适宜推广应用[4].高效液相色谱法对仪器要求不高，检测成本低，且具有较好的分离效果和较低的检出限，适于大规模推广[5].Ghaedian 等[6]利用高效液相色谱法测定出尿酸具有相对高的热稳定性，可以作为检测粮食中昆虫的指示物.Wetzel 等[7]使用高效液相色谱法检测谷物和粮食产品中尿酸的含量作为昆虫侵染的测量方法，确定了提取尿酸的方法以及色谱检测的基本参数，但没有说明尿酸的含量与害虫感染程度、粮粒之间的关系.Wehling 等[8]利用高效液相色谱法研究了不同虫态下害虫感染的籽粒与尿酸的关系，在整籽粒中发现，尿酸含量与昆虫为害水平呈很好的相关关系，但没有说明害虫虫口密度、感染时间和尿酸含量的关系.作者研究了高效液相色谱法的灵敏度、检测限以及检测的尿酸含量与不同害虫虫口密度、感染时间之间的对应关系，预期建立小麦粉中尿酸含量与小麦粉中害虫感染程度的模型，并根据此模型和快速测定的尿酸含量来预测面粉中害虫的感染程度，对生产实践的检验具有一定的指导意义.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试虫

赤拟谷盗（Tribolium castaneum）和锯谷盗（Oryzaephilus surinamensis）均采自河南省郑州市国家粮食储备库，在河南工业大学粮食储运工程中心实验室培养数代.

1.1.2 供试小麦粉

选用无虫害的小麦，将其除去杂质后用自来水洗干净，放入烘箱中60 ℃下烘2～3 h，烘干（具体时间视为将小麦的水分含量调至（14±0.5）%为宜）.将小麦取出冷却至室温，一部分用实验室小麦磨粉机磨成小麦粉，另一部分用垂直旋风磨磨成全麦粉.过80 目筛子，筛下物即为所需的小麦粉样品.

1.1.3 小麦粉害虫感染的处理方法

（1）感染1 头成虫的方法.取72 个玻璃瓶，其中36 瓶各放入1 头赤拟谷盗成虫，另外36 瓶各放入1 头锯谷盗成虫，分为3 个密度梯度分别放入50、100、200 g 的面粉，用纱布封紧瓶口；置于（28±3）℃和RH（65±10）%的培养箱中培养，感染时间分别为7、14、21、28 d，每个处理重复3 次.测定尿酸之前，过筛除虫，混匀小麦粉后取样.

（2）感染1 头幼虫的方法.取72 个玻璃瓶，其中36 瓶各放入1 头赤拟谷盗幼虫，另外36 瓶各放入1 头锯谷盗幼虫，分为3 个密度梯度分别放入50、100、200 g 的面粉，用纱布封紧瓶口；置于（28±3）℃和RH（65±10）%的培养箱中培养，感染时间分别为7、14、21、28 d，每个处理重复3 次.测定尿酸之前，过筛除虫，混匀小麦粉后取样.

（3）不同虫口密度幼虫的感染方法.取60 个玻璃瓶，每瓶放入小麦粉50 g，分为5 个密度梯度，分别放入赤拟谷盗和锯谷盗的幼虫2、4、6、8、10 头，用纱布封紧瓶口；置于（28±3）℃和RH（65±10）%的培养箱中培养，分别培养7 d 和14 d，每个处理重复3 次.测定尿酸之前过筛除虫.

（4）不同虫口密度成虫的感染方法.取75 个玻璃瓶，每瓶放入小麦粉200 g，分为5 个密度梯度，分别放入赤拟谷盗成虫1、3、5、7、9 头，用纱布封紧瓶口；置于（28±3）℃和RH（65±10）%的培养箱中培养，5 个时间梯度分别为7、14、21、28 d，每个处理重复3 次.测定尿酸之前过筛除虫，混匀小麦粉后取样.

1.1.4 面粉厂小麦粉的取样方法

为了确定高效液相色谱法的准确度，从河南金苑面粉厂的小麦粉车间随机抽取生产一周小麦粉作为检测的样品，每份1 000 g 的小麦粉取具有代表性的部位进行扦样.取5 g 样品，重复3 次，放置在密封的干燥器中，干燥器放置在（28±3）℃和RH（65±10）%的培养箱中30 d，利用筛网人工检测小麦粉中害虫的数量作为实际虫数，取适量的小麦粉进行尿酸检测.

1.2 主要仪器

AUY220 型分析天平、Prominenece UFLC 高效液相色谱仪、Shim-pack VP-ODS 色谱柱：日本岛津有限公司；SPX-250B 型生化培养箱：上海跃进医用光学器械厂；SL101PAB-1 型电热鼓风恒温干燥箱、双列四孔仪表恒温水浴锅：上海树立仪器仪表有限公司；分样筛80#、100#：浙江上虞市五四仪器筛具厂；BCD-215KLM 冰箱：青岛海尔股份有限公司；KDL-160HR 高速冷冻离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；PHS-3C 型酸度计：上海精密科学仪器有限公司；Milli-Q Advantage A10 纯水机：美国密理博有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 尿酸标准液的制备

将尿酸标准品用1.0%乙酸钠溶液充分溶解，振荡，配成1 mg／mL 的尿酸母液.取标准母液溶于1.0%乙酸钠溶液分别配成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL 的标准工作液.

1.3.2 小麦粉中尿酸的提取

称取5.0 g 样品于100 mL 小烧杯中.加入10.0 mL 1 mol/L 盐酸，然后将烧杯放置在55～60 ℃水浴锅中，水浴15 min.从水浴锅中取出，并加入30 mL蒸馏水.加入5 mol/L NaOH 中和提取物，逐滴加入0.5 mol/L NaOH 调节提取液，使得pH 值至9.0～10.0，再加入2 滴二硫化碳.倒入50 mL 离心管中，塞上塞子用手腕力摇晃混匀5 min，在离心力2 000 g 下离心15 min，提取液的最终pH 值应介于8.5～9.5.离心后，将上清液轻轻倒入50 mL的容量瓶，加入蒸馏水稀释至一定体积.取上清液过0.45 μm 微孔滤膜，收集滤液，待检测.

1.3.3 尿酸回收率的测定

分别取1 mL 配制好的0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%尿酸标准液，添加到装有5 g 小麦粉的100 mL 烧杯中，按1.3.2 中的操作方法，每个样品重复3 次，利用高效液相色谱法测定其峰面积，计算尿酸含量，从而计算回收率.

1.3.4 测定尿酸在面粉中降解的方法

分别取1 mL 配制好的0.2%、0.6%、10.0%尿酸标准液，分别添加到装有5 g 小麦粉和全麦粉的100 mL 烧杯中，混匀，配制成面粉中尿酸含量分别为2、6、10 μg/g：分别放置7、14、21、28 d，每个试验重复3 次；分别测定不同时间后小麦粉和全麦粉中尿酸的含量，计算尿酸在小麦粉和全麦粉中的降解情况.

1.3.5 高效液相色谱的色谱分析条件

色谱柱为C18 柱；流动相为超纯水∶甲醇（V∶V）=890∶110；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；检测波长为280 nm；流速为0.8 mL/min，分析时间为25 min.

配制流动相:在1 L 的容量瓶中，用少量重蒸水溶解1.697 g 的四丁基磷酸二氢铵、0.560 g 磷酸二氢钾和0.480 g 磷酸氢二钠.然后倒入110 mL 甲醇，再加入一定量的水定容.流动相的最终pH 值应为6.6～6.7.

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱法分析尿酸含量的灵敏度和检测限

将尿酸标准溶液，依次利用高效液相色谱仪进行检测，检测色谱图如图1 所示，结果表明：色谱对尿酸标准溶液的检出限为1 μg/mL，小麦粉中尿酸的最低检测限为1.48 μg/g 面粉.当尿酸标准溶液的含量在1～100 μg/mL 的范围内，色谱峰面积与尿酸浓度之间有很好的相关性：Y=3 959.0X-2 275.5（r=0.996 2）.

图1 高效液相色谱检测的尿酸标准溶液与小麦粉尿酸的最低检测限色谱图Fig.1 HPLC Chromatograph of minimum detection limit of uric acid in standard solution and wheat flour

2.2 高效液相色谱法检测小麦粉中尿酸的回收率

将不同质量的尿酸添加到自制空白小麦粉中进行尿酸回收率的测定，添加尿酸的浓度分别为2、4、8、16、32 mg/g，每组重复3 次，回收率和相对标准偏差结果见表1.

表1 添加不同量尿酸的面粉中色谱检测尿酸的回收率Table 1 Recovery of uric acid detected by HPLC in flour by add different amounts of uric acid

从表1 可以看出，尿酸的回收率在91%～99%之间，相对标准偏差均小于1.6%.说明利用高效液相色谱法测定小麦粉中的尿酸的方法具有较高的准确度和精确度.

2.3 尿酸在面粉中的降解动态

为了测试尿酸在小麦粉中是否降解以至于影响测定害虫感染程度的准确性，在自制的小麦粉中全麦粉中分别添加不同含量的尿酸，分别测定7、14、21、28 d 后尿酸的含量，结果如表2 所示.

从表2 可以看出，尿酸在全麦粉和小麦粉中经过28 d 后稍微有所降解，但除了尿酸含量在10 μg/g 时21 d 和28 d 后差异显著外，其他含量尿酸在不同时间后差异均不显著，说明在一定浓度范围内尿酸在小麦粉和全麦粉中降解不显著.另外发现在加入相同浓度的尿酸的情况下，全麦粉中的尿酸含量比小麦粉中的少.说明全麦粉中可能存在吸收或者降解尿酸的成分.

表2 自制的全麦粉和小麦粉中尿酸的降解动态Table 2 Degradation dynamics of uric acid in self made whole wheat flour and wheat flour

2.4 小麦粉中尿酸的含量与害虫感染时间-虫口密度的关系

为了测定小麦粉感染不同虫口密度的害虫以及感染不同时间与尿酸含量的变化，利用响应面法分析了尿酸的含量与不同害虫的不同感染时间和不同虫口密度之间的关系，结果如图2 所示.

从图2 可以看出，4 个3D 图均倾向于上升趋势，表明感染时间和虫口密度增加，尿酸含量相应增加.根据图2 及Design Expert 软件分析得出，3D图形的倾斜率大小排序为图2-Ⅰ＞图2-Ⅲ＞图2-Ⅱ＞图2-Ⅳ；相同条件下，检测到的赤拟谷盗成虫尿酸比其幼虫多；锯谷盗成虫尿酸比其幼虫多.并且得到的Z 尿酸含量=f（感染时间（X），虫口密度（Y））回归方程分别为：

图2 小麦粉中尿酸含量与感染时间-虫口密度关系的响应面Fig.2 Response surface of the relationship among uric acid content in wheat flour and inset infection time and density

对回归方程模型进行方差分析显示，模型大于F 值的概率P＜0.000 1，表明模型可信度较高，模型的相关系数均大于0.955 4，说明拟合的回归方程符合实际情况，可用此模型和测定的面粉中尿酸含量进行小麦粉中害虫的感染程度进行预测.

2.5 面粉厂随机取样的小麦粉中尿酸的含量检测

在面粉厂随机取了7 份小麦粉，30 d 后进行尿酸含量测定和害虫实际发生情况的调查，根据实际害虫发生的情况，利用公式（1）、（2）对其尿酸的含量进行了预测，检测值和预测值的结果比较如表3 所示.

表3 随机取7 份小麦粉30 d 后测定的尿酸含量与根据回归方程和害虫实际发生情况预测的尿酸的含量比较Table 3 Comparison uric acid content detected in wheat flour from mill and predicted value by actual pest number and regression equation

从表3 可以看出，自制小麦粉中，没有检测出尿酸也没有发现害虫.随机取样的小麦粉中尿酸含量随着实际害虫数量的增加而增加，说明了通过检测尿酸的含量可以推测样品中害虫的感染程度.利用高效液相色谱测定7 份小麦粉样品检测出来的尿酸含量与根据害虫的实际发生量结合回归方程计算出的预测值相比，准确率均在83.00%～99.60%.结果说明了利用高效液相色谱法测定的小麦粉中尿酸的含量可以预测小麦粉中害虫的感染程度.

3 讨论

目前尿酸的检测方法主要有酶法、尿酸传感器检测法、伏安法、磷钨酸还原法、高效液相色谱法等.主要用于人的尿酸检测的方法有单酶法、微电极差示脉冲伏安法、吸附溶出伏安法等[9].用于昆虫尿酸的检测方法主要是磷钨酸还原法和高效液相色谱法，磷钨酸还原法检测昆虫分泌的尿酸的灵敏度低[10]，待测液的光密度值的直线方程为：y=-408 x+99.2；直线范围在90.8～40.0 之外的测定结果误差会很大，且检测限较高，粮食中尿酸含量必须在0.3 mg/g 以上才能检测出.研究表明利用高效液相色谱法对尿酸的最低检出限是1 μg/mL，对小麦粉中尿酸的最低检测限为1.48 μg/g 面粉，说明了该方法灵敏度较高.检测小麦粉中尿酸的回收率均在91%以上，标准偏差小于1.6%，另外而且尿酸在面粉中的降解速度缓慢，结果均说明利用高效液相色谱法可以准确地检测出小麦粉中的尿酸的含量，而且不受样品的取样时间的影响.

在实际的面粉质量的检测过程中需要根据检测的尿酸的含量来判断小麦粉中害虫的为害程度，文中根据不同的害虫不同的感染程度，如不同的虫口密度和感染时间与测定的尿酸的含量的回归方程，并在实际的小麦粉中进行了验证，检测的准确率在83%以上.和目前国际上普遍使用的昆虫碎片计数法相比，高效液相色谱法为测定尿酸提供了一种更实用、更客观的方法.根据实际取样的检测效果来看，高效液相色谱法能够正确判断出感染情况.因此此方法可以用于实际商品中害虫感染水平的定量和定性检测.

在小麦粉尿酸提取过程中，使用NaOH 溶液调节提取液pH 值时，添加速度一定注意缓慢，边添加边使用pH 酸度计测量，防止pH 值偏大或偏小，从而影响试验结果.在尿酸降解动态的研究中发现全麦粉中尿酸含量比小麦粉中的低，推测全麦粉中可能含尿酸降解或者分解的物质，具体哪种物质有待研究.

4 结论

利用高效液相色谱法测定尿酸的最低检出限是1 μg/mL，测定小麦粉中尿酸的检出限是1.48 μg/g 小麦粉，对小麦粉中尿酸的回收率在91%～99%之间，相对标准偏差均小于1.6%，说明了高效液相色谱法可以准确地检测小麦粉中的尿酸的含量.并且在一定浓度范围内，小麦粉中尿酸降解度不显著，只有当保存时间达到21 d 之后降解速率差异才显著.检测的小麦粉中尿酸含量与害虫虫口密度-感染时间呈很好的相关关系，且赤拟谷盗成虫感染时间和虫口密度与检测出尿酸的含量的回归方程为Z=10.35 +4.42X +6.11Y +1.32XY -0.06X2+1.06Y2.对于回归方程的应用，面粉厂随机抽取7 份小麦粉样品进行尿酸检测，其检测值与根据回归方程和实际的虫口密度预测的尿酸含量相比，准确率在83.00%～ 99.60%之间，说明可以利用高效液相色谱方法检测小麦粉中尿酸的含量来预测面粉中害虫的感染程度.

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