中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子对糖氧剥夺/再灌注诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

孙　瑞，刘　珺，沈玉君，沙曼琪，徐胜春，沈玉先

(安徽医科大学1.基础医学院、2.生物药物研究所，安徽合肥　230032;3.解放军第306医院心血管内科，北京　100010)



中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子对糖氧剥夺/再灌注诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

孙瑞1，2，3，刘珺1，2，沈玉君1，2，沙曼琪1，2，徐胜春1，沈玉先1，2

(安徽医科大学1.基础医学院、2.生物药物研究所，安徽合肥230032;3.解放军第306医院心血管内科，北京100010)

摘要:目的研究中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)对糖氧剥夺/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)诱导的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)损伤的保护作用。方法体外培养SH-SY5Y细胞，对细胞进行糖氧剥夺(OGD) 6 h，再灌注(R) 12 h。在再灌注时期，根据是否给予重组人MANF蛋白处理(2 μmol·L(－1)，12 h)，将细胞分为正常对照组(NC)、NC+ MANF组、OGD/R组和OGD/R+ MANF组。随后光学显微镜下观察SH-SY5Y细胞形态的改变，MTT法检测细胞存活率，PI染色法检测细胞死亡率，免疫印迹法检测内源性MANF蛋白、内质网(ER)应激相关蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α及促凋亡蛋白cleaved caspase-3和CHOP的表达。结果光学显微镜下可见OGD/R组SH-SY5Y细胞胞体变小、变圆，突起缩短或消失。进一步研究发现，MANF能明显改善OGD/R诱导的SHSY5Y细胞存活率下降和死亡率增加。免疫印迹法检测发现: OGD/R组细胞内源性MANF蛋白表达增高; ER应激相关蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α表达增高;促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表达明显高于NC组。给予重组人MANF蛋白可降低OGD/R组GRP78/BiP、CHOP及cleaved caspase-3的表达水平。结论OGD/R可诱导凋亡性ER应激; MANF蛋白可通过抑制OGD/R诱导的凋亡性ER应激而对SH-SY5Y细胞具有保护作用。

关键词:糖氧剥夺/再灌注;内质网应激;凋亡; MANF;非折叠蛋白反应;神经保护

组织器官在缺血后进行血液再灌注时可能导致缺血/再灌注损伤的发生。缺血缺氧可导致细胞膜通透性增加、线粒体及溶酶体损伤。再灌注时期由于氧自由基大量释放、细胞内钙超载、炎症细胞浸润等多种因素作用，可引起细胞代谢和功能障碍，发生形态和结构改变，甚至导致细胞死亡。内质网(ER)应激是启动细胞凋亡的重要途径之一，研究表明ER应激参与了心、脑、肾等重要器官缺血再灌注损伤的病理生理过程［1－3］。中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)在ER应激时特异的表达上调［4］，在脑缺血、糖尿病、缺血性心脏病等多种病理状态下发挥保护作用［5－9］，但MANF的保护作用机制尚不十分明确。本研究发现，MANF蛋白可明显改善OGD/R诱导损伤的SH-SY5Y细胞状态，并对ER应激相关蛋白的改变有抑制作用，尤其是减少促凋亡蛋白CHOP及cleaved caspase-3的表达。本研究将为理解MANF在缺血/再灌注损伤中的保护作 用提供实验依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞及主要试剂SH-SY5Y细胞为本实验室保存。高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青公司。甲基偶氮唑盐(MTT)、DAPI、PI染料购自美国Sigma公司。ECL底物发光试剂盒购自美国Thermo公司。CHOP/GADD153抗体购自美国Santa Cruz生物公司，MANF、GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α、cleaved caspase-3抗体购自美国Abcam公司，α-tubulin抗体购自美国Sigma公司。重组人MANF蛋白由本实验室自备。Galaxy 170R三气培养箱购自德国Eppendorf公司，荧光倒置显微镜购自日本OLYMPUS公司，Synergy HT型多功能酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养SH-SY5Y细胞培养于含10%胎牛血清，100 kU·L－1青霉素及100 mg·L－1链霉素的DMEM培养基中，置于5% CO2，37℃培养箱，隔日换液1次，3～4 d传代1次。

1.2.2缺血/再灌注损伤模型的建立收集对数生长期SH-SY5Y细胞，分为NC组和OGD/R组。待细胞贴壁后OGD/R组在糖氧剥夺期更换为预热的无葡萄糖平衡盐溶液(a glucose-free Earle’s balanced salt solution，BSS) : NaCl 116 mmol·L－1，KCl 5.4 mmol·L－1，MgSO4·7H2O 0.8 mmol·L－1，NaH2PO4·2H2O 1 mmol·L－1，NaHCO326.2 mmol ·L－1，Glycine 0.01 mmol·L－1，CaCl2·2H2O 1.8 mmol·L－1，pH 7.4，放入含1% O2，5% CO2，94% N2，37℃饱和温湿三气培养箱中，初以5 L·min－1，30 min后培养箱内O2浓度降至1%，持续充入缺氧混合气体，维持培养箱内O2浓度低于1%，并开始计时，进行糖氧剥夺6 h。之后两组细胞分别更换为含有2 μmol·L－1重组人MANF蛋白的DMEM培养基，在5% CO2，37℃，饱和湿度培养箱中再灌注12 h。使用倒置显微镜观察细胞的形态，并检测细胞存活率及死亡率，以及ER应激相关蛋白和促凋亡相关蛋白的表达。

1.2.3MTT法检测细胞存活率接种于96孔板的SH-SY5Y细胞，在OGD/R处理结束后加入5 g· L－1MTT溶液10 μL(终浓度为0.5 g·L－1)作用4 h。之后加入150 μL DMSO溶液，使结晶物甲臜溶解，室温震荡10 min，使用酶联免疫检测仪，测量吸光度(optical density，OD) 570 nm处各孔的吸光值。各组细胞存活率/%=(该组OD值均值－空白对照OD值均值)/(NC组OD值均值－空白对照OD值均值)×100%。

1.2.4PI染色检测细胞死亡率SH-SY5Y细胞培养于24孔板内，预先加入含有5 mg·L－1DPAI的DMEM培养基过夜培养，衬染细胞核，避光操作。待OGD/R处理结束后，各孔加入50 mg·L－1PI染料2 μL，室温孵育5 min，轻混匀后在荧光倒置显微镜下观察，细胞核为蓝色荧光，死亡细胞核为红色荧光。随机选取5个视野(100×)，Image-Pro Plus软件计算各视野细胞数，计算细胞死亡率。

1.2.5免疫印迹法检测经OGD/R处理后MANF蛋白、ER应激及凋亡相关蛋白的表达SH-SY5Y

细胞接种于6孔板，OGD/R处理结束后，使用RIPA裂解液(Tris，pH 7.4; 150 mmol·L－1NaCl，1% NP-40，0.25% sodium deoxycholate)提取细胞总蛋白，煮沸变性后，用15% SDS-PAGE凝胶分离，转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入适当稀释度的一抗，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，PBS-Triton洗涤后ECL化学发光显色，Adobe Photoshop CS5 Extended软件计算灰度值并进行统计学分析。

1.3统计学处理采用SPSS 16.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料以±s表示，组间数据的显著性检验采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验。

Fig 1 Recombinant human MANF inhibits the decrease of OGD/R-induced cell proliferation

2　结果

2.1重组人MANF改善OGD/R诱导损伤的SHSY5Y细胞增殖活性光镜下可见NC组SH-SY5Y细胞呈单层贴壁生长，多有突起(Fig 1 A1)。OGD/R组细胞体积变小，突触变短或消失(Fig 1 A2)，MANF明显改善该细胞的状态(Fig 1 A3)。MTT结果显示，OGD/R组SH-SY5Y细胞增殖能力下降，明显低于NC组(P＜0.01)，OGD+ MANF组细胞增殖活性明显高于OGD/R组(P＜0.05) (Fig 1B)。该结果表明重组人MANF蛋白对OGD/R诱导的细胞损伤有抑制作用。

2.2重组人MANF抑制OGD/R诱导的SHSY5Y细胞死亡PI染色可见NC组及NC+ MANF组仅有少量PI染色阳性细胞(Fig 2 A2，A5)，而OGD/R组PI染色阳性细胞明显多于NC组(P＜0.01) (Fig 2 A8)。OGD/R+ MANF组较OGD/R组死亡细胞数明显减少，死亡率下降(P＜0.05) (Fig 2 A11)。该结果表明，重组人MANF蛋白能抑制OGD/R诱导的细胞死亡。

Fig 2 Recombinant human MANF inhibits OGD/R-induced cell death

2.3OGD/R诱导的ER应激相关蛋白表达及MANF的作用用免疫印迹方法检测ER应激相关蛋白时发现，OGD/R组SH-SY5Y细胞ER应激相关蛋白GRP78/BiP、p-IRE1、p-eIF2α、MANF的表达均明显高于NC组(P＜0.01) (Fig 3)，提示OGD/R可诱导SH-SY5Y细胞发生ER应激。给予重组人MANF蛋白处理后，由OGD/R上调的GRP78/BiP和CHOP的表达量均有所降低(Fig 4)。

2.4OGD/R诱导的促凋亡蛋白表达及MANF的作用在检测ER应激相关蛋白时发现，OGD/R组促凋亡蛋白CHOP表达增加，该结果提示OGD/R可能诱导了凋亡性的ER应激。为了进一步验证该结果，我们对caspase-3进行了检测，结果发现，与NC组比较，激活性的caspase-3水平也明显增加(P＜0.01)。这些结果提示OGD/R可诱导凋亡性ER应激(Fig 3)。同时发现，给予重组人MANF蛋白干预后，由OGD/R上调的CHOP和cleaved caspase-3的水平被抑制(P＜0.05) (Fig 4)。

Fig 3 Protein levels of endogenous MANF，ER stress-associated proteins，and apoptosis-associatedproteins(performed by Western blot)

3　讨论

现已证实，心、脑、肝、肾及胃肠道等多种组织器官都存在缺血/再灌注损伤的现象。缺血/再灌注的发生机制尚未阐明，目前认为自由基的作用、细胞内钙超载和白细胞的激活是缺血/再灌注损伤的主要发病环节。近年来的研究表明，ER应激在缺血/再灌注导致的细胞凋亡中具有重要作用［1－2，10］。

Fig 4 Recombinant human MANF inhibits the expression of ER stress associated proteins and pro-apoptotic protein induced by OGD/R

ER应激是启动凋亡的主要途径之一。ER应激触发了一个复杂的信号网络和细胞内非折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)过程。UPR主要通过3种跨膜效应蛋白(PERK、IRE1和ATF6)的活化，调节蛋白质的合成、修饰及降解，维持ER内环境稳定，促进细胞存活。在生理状态下，PERK、IRE1和ATF6与GRP78/BiP结合而处于抑制状态。发生ER应激时，PERK、IRE1和ATF6与GRP78/BiP解离，GRP78/BiP与未折叠或错误折叠的蛋白质结合，以促进蛋白质正确折叠，同时PERK、IRE1 和ATF6被激活［11］。PERK激活后催化其底物eIF2α发生磷酸化，使蛋白质合成暂停。IRE1α具有激酶和核糖核酸内切酶活性，可对XBP1进行剪切，生产XBP1的活性形式XBP1s，XBP1s促进蛋白质正确折叠后由ER输出，并加强错误折叠及未折叠蛋白的降解，维持ER的稳态［12］。本研究发现，OGD/R可上调ER应激标志蛋白GRP78/BiP的表达及激活UPR通路效应蛋白IRE1和PERK，提示OGD/R可诱导ER应激，导致PERK/eIF2α和IRE1/XBP1s通路激活，模拟体外缺氧缺血诱导的SH-SY5Y细胞损伤过程。

ER应激是机体应对损伤的一种保护性的反应，故称为适应性ER应激。但当刺激因素过强，或ER应激持续存在而超过机体的代偿能力，则ER应激变得不可逆，从而出现凋亡性ER应激。CHOP是ER应激特异的转录因子，属于转录因子家族成员［13］，PERK、ATF6以及IRE1都能诱导CHOP的转录。在正常情况下CHOP主要存在于细胞质中，含量很低，细胞处于应激状态时，CHOP的表达量大大增加并聚集在细胞核内，过量表达的CHOP能促进细胞凋亡［14］。caspase-3是凋亡的关键蛋白，caspase-3经剪切后成为活化型caspase-3 (cleaved caspase-3)，水解其蛋白底物，导致细胞凋亡。本研究发现OGD/R可上调CHOP和cleaved caspase-3的水平，提示OGD/R在凋亡性的ER应激中发挥重要作用。

MANF是神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)家族成员，是1种分泌蛋白，在ER应激时特异性的表达上调，分子伴侣GRP78/BiP与MANF相互作用，并能调节MANF的分泌［1］。近年来的一些研究结果显示，MANF作为1个新型的神经保护因子，可进入细胞内与凋亡相关蛋白结合发挥细胞保护作用［5］。MANF包括两个结构域:氨基末端的鞘脂激活蛋白样结构域，可与脂质膜相互作用，其羧基末端结构域可能具有保护细胞应对ER应激的作用。越来越多的证据表明MANF是1个ER应激反应蛋白，在体外实验中MANF能够保护细胞应对ER应激反应诱导的细胞死亡［4］。晶体结构表明MANF可以帮助蛋白质在ER内折叠。MANF的C-末端结构域，模体127CKGC130有两个半胱氨酸形成，一个C-末端二硫键可能有助于形成半胱氨酸桥并帮助蛋白质折叠，从而减少未折叠或错误折叠的蛋白质引起的ER应激［15］。本研究探讨MANF对OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用。研究结果表明，再灌注时期给予MANF处理能够抑制OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞的细胞活力下降，减少OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞死亡率增加，表明MANF能够减轻OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤。此外，Western blot显示，经MANF蛋白处理之后，OGD/R诱导的ER应激标志物GRP78增加能够被MANF明显抑制，并且MANF能够减少ER应激特异的促凋亡蛋白CHOP和凋亡执行分子cleaved caspase-3的表达，表明MANF通过抑制SH-SY5Y细胞ER应激抑制凋亡。因此，MANF在SH-SY5Y细胞应对ER应激诱导的损伤中起着重要的作用。本研究为理解低氧诱导的损伤机制以及MANF在缺血/再灌注损伤中的保护作用提供了实验依据。

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Protective effects of MANF on oxygen-glucose deprivation/reperfusion-induced apoptotic ER stress in SH-SY5Y neural cells

SUN Rui1，2，3，LIU Jun1，2，SHEN Yu-jun1，2，SHA Man-qi1，2，XU Sheng-chun1，SHEN Yu-xian1，2
(1.School of Basic Medical Sciences，Anhui Medical University，Hefei 230032，China; 2.Institute of Biopharmaceutical Research，Anhui Medical University，Hefei 230032，China; 3.Dept of Cardiology，the 306th Hospital of PLA，Beijing 100101，China)

Abstract:AimTo investigate the protective effects of MANF on human neuroblastoma SH-SY5Y cells suffering fromoxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R) and the underlying mechanism.Methods SH-SY5Y cells were treated with OGD for 6 h，followed by reperfusion for 12 h.Meanwhile，the cells were incubated with 2 μmol·L(－1)recombinant human protein MANF for 12 h during reperfusion.The cell morphology was observed under an optical microscope.The cell viability was determined by MTT assay.PI staining was performed to detect the number of dead cells.Western blot was performed to determine the protein levels of endogenous MANF，glucose-related protein 78 (GRP78/BiP)，phosphorylated inositol requiring enzyme 1 (p-IRE1)，phosphorylated eukaryotic translation initiator factor 2α(p-eIF2α)，cleaved caspase-3，and C/EBP-homologous protein (CHOP).Results The cells exposed to OGD/R became smaller and round，and the neurites of the cells were shortened or disappeared.Recombinant human protein MANFbook=815,ebook=80improved the survival rate (P＜0.05) and decreased the death rate (P＜0.05) of SH-SY5Y cells treated with by OGD/R.Western blot assay showed that the endoplasmic reticulum (ER) stress-associated proteins GRP78/BiP，p-IRE1，p-eIF2α，and MANF were increased significantly after OGD/R treatment，compared with the untreated controls.However，the increases of secretion levels of apoptosis-associated proteins CHOP and cleaved caspase-3 in SH-SY5Y cells induced by OGD/R were significantly suppressed by MANF.Conclusion OGD/R up-regulates the ER stress-associated proteins and causes apoptosis.MANF inhibits OGD/R-induced cell death，which may be related to attenuating ER stress-induced apoptosis.

Key words:OGD/R; ER stress; apoptosis; MANF; UPR; neuroprotection

作者简介:孙瑞(1984－)，女，硕士生，E-mail: 1246056597@ qq.com;徐胜春(1963－)，男，硕士，教授，硕士生导师，研究方向:临床应用解剖，通讯作者，Tel: 0551-65161147，E-mail: chun028@163.com;沈玉先(1965－)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向:功能性蛋白与药物作用靶点，通讯作者，Tel: 0551-65113750，E-mail: shenyx@ ustc.edu.cn

基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81173074，91129729，81372576)

收稿日期:2015－02－08，修回日期:2015－03－15

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015) 06－0810－06中国图书分类号: R322.81; R329.24; R329.25; R845.22; R977.6

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.015