红景天苷对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用

赖文芳，张小琴，洪海棉，谢秀利，洪桂祝

(福建中医药大学1.药学院、2.中西医结合研究院，福建福州　350122)



红景天苷对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用

赖文芳1，2，张小琴1，洪海棉1，谢秀利1，洪桂祝1

(福建中医药大学1.药学院、2.中西医结合研究院，福建福州350122)

摘要:目的探讨红景天苷(salidroside，Sal)对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用及其机制。方法健康成年♂SD大鼠36只，随机分为3组:假手术组(sham)、模型对照组(MCAO组)、红景天苷给药组(MCAO+ Sal组)。通过线栓法制作大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤模型，Longa评分法对大鼠神经功能损伤评分，焦油紫染色法对神经细胞内尼氏(Nissl)小体染色，RT-qPCR技术检测大鼠缺血侧脑组织Neun、Nogo-A与NgR mRNA的表达，Western blot法检测大鼠缺血侧脑组织Bcl-2、Neun、BDNF、NGF、Nogo-A与NgR蛋白的表达。结果与MCAO组比较，红景天苷能明显降低神经功能损伤，增加Nissl阳性细胞的数量，促进Bcl-2、Neun、NGF、BDNF的蛋白表达，降低Nogo-A及其受体NgR 的mRNA及蛋白表达。结论红景天苷能够降低MCAO模型大鼠神经功能损伤，增加Nissl阳性细胞数目，提高Neun的表达，具有神经保护作用，此作用是通过促进抗凋亡因子Bcl-2及神经营养因子NGF、BDNF的蛋白表达，下调轴突生长抑制因子Nogo-A及其受体NgR的蛋白表达所实现。

关键词:红景天苷;局灶性脑缺血/再灌注;轴突生长抑制因子;神经生长因子;神经保护;细胞凋亡

脑卒中，俗称脑中风，是脑血管疾病最严重的并发症。过去的30年，全球共有将近200个治疗脑卒中药物进入临床试验，只有组织型纤维蛋白溶活剂(tPA)获得美国FDA的临床应用批件。然而，由于tPA只能用于脑血栓病人的缺点，该药物仅对3%～5%的脑中风病人有治疗的效果［1－2］。专家们普遍认为，选择具有神经保护作用的候选药物进行研发，可提高脑卒中药物研发成功的机会［3－4］。

红景天是景天科红景天属植物高山红景天(Rhodiold rosea L.)的干燥根茎，其性寒、味甘涩，根据中国药典2010版，红景天的功能与主治为“益气活血，通脉平喘。用于气虚血瘀，胸痹心痛，中风偏瘫，倦怠气喘”。红景天苷(salidroside，Sal)是红景天的主要有效成分，在局灶性脑缺血/再灌注大鼠模型中，红景天苷可减少大鼠局灶性脑缺血/再灌注(MCAO)大脑的梗死体积和降低脑缺血大鼠神经功能缺损评分［5－6］，但其确切机制还不清楚。本研究旨在观察红景天苷对MCAO模型大鼠脑组织内抗凋亡基因Bcl-2、神经元特异核蛋白抗原(neuronal nuclei/neuron-specific protein，NeuN)、神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)及轴突生长抑制因子(Nogo-A)及其受体NgR mRNA及蛋白表达水平的影响，进一步探讨红景天苷对MCAO模型大鼠神经保护的作用机制。

1　材料

1.1实验动物健康成年♂，SD大鼠36只，SPF级，体质量260－300g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号: 2007000509960，许可证号: SCXK(沪) 2007－0005，由福建中医药大学实验动物中心饲养。

1.2主要仪器与试剂凝胶成像分析系统(Bio-Rad，型号: ChemiDoc XRS+ )，PCR仪(Bio-Rad，型号: C1000)，荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，型号:7900HT)，高速台式冷冻离心机(Thermo Fisher，型号: Primo R)。Bcl-2多克隆抗体(Santa Cruz，sc-492)，Neun单克隆抗体(Cell Sigaling，#12943)，NGF多克隆抗体(Santa Cruz，sc-365944)，BDNF多克隆抗体(Santa Cruz，sc-546)，Nogo-A多克隆抗体(Santa Cruz，sc-25660)，NgR多克隆抗体(Santa Cruz，sc-168752)，β-actin抗体(碧云天生物技术研究所，货号: H015)，RNeasyMini Kit(QIAGEN，货号:74106)，RT试剂盒(Fermentas，货号: K1622)，荧光定量PCR Master Mix(Applied Biosystems，货号: R11022)，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，参照Gen Bank中大鼠Neun、Nogo-A、NgR、GAPDH mRNA序列，Neun引物上游序列5'-GGGTTTTGGGTTTGTAACTTTTGAA-3';下游序列5'-AGACTGCTCCTACCACAGGGTTTAG-3'，PCR扩增片段长度为188 bp。Nogo-A引物上游序列5'-GGAGAACAACTTGGACGGCTATG-3';下游序列5'-GCATCTCACGCTTGACCCAG-3'，PCR扩增片段长度为128 bp。NgR引物上游序列5'-GATGATGCTCTTAGTGGACCTGTG-3';下游序列5'-CGATACTCAAAAGTCACACGGTTCA-3'，PCR扩增片段长度为129 bp。GAPDH引物上游序列5'-CAACGGGAAACCCATCACCA-3';下游序列5'-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3'，PCR扩增片段长度为96 bp。红景天苷由北京大学提供，纯度为98%。尼氏(Nissl)染色液(碧云天生物技术研究所，货号: C0117)。

2　实验方法

2.1MCAO动物模型制作大鼠经适应性喂养后，腹腔注射10%水合氯醛(3 ml·kg－1体质量)麻醉动物。将甲聚硅氧烷涂层的尼龙单丝从左颈总动脉插入到大脑中动脉的起始端。栓塞后2 h，将尼龙单丝拔出。假手术动物不栓塞中脑动脉。在操作过程中，连续监测动物的温度，并把温度保持37℃。参照Longa评定法，进行神经功能损伤程度的评价，3～4级为模型制作成功，可用于实验。

2.2实验分组与处理实验大鼠分为假手术组(sham)，把成模的动物随机分为模型对照组(MCAO)和红景天苷给药组(MCAO+ Sal)，每组12只。MCAO+ Sal组在栓塞2 h后立即腹腔注射红景天苷(50 mg·kg－1)，连续给药6 d，于末次给药4 h后，每组实验动物断头取脑，用于实验。

2.3评价神经功能损伤参照Longa评定法，每天对大鼠进行神经功能损伤程度的评价: 0级，无缺陷; 1级，不能伸展对侧前肢;2级，对侧前肢屈曲;3级，轻度向对侧转圈;4级，严重的转圈;5级，对侧瘫痪。

2.4Nissl染色脑组织以福尔马林液固定，充分水洗后，以石蜡包埋，切片厚度为10 μm;将切片脱蜡后至50%酒精内，放入37℃温箱12 h;切片由酒精中取出，放入0.06%焦油紫液，将切片放置56℃温箱内染色1 h;用蒸馏水洗去浮色，放入70%酒精分化，至显微镜下观察时见背景无色，细胞及尼氏小体有明显的轮廓为度;以无水酒精急速脱水5 s，入氯仿5 s，二甲苯透明，香胶封固;尼氏小体呈紫色。

2.5荧光实时定量PCR检测大鼠脑组织Neun、Nogo-A、NgR mRNA表达按照QIAGEN RNeasyMini Kit试剂盒提取总RNA，用RT逆转录试剂盒逆转录成cDNA，以cDNA为模板，建立qPCR体系为20 μl，反应条件为50℃2 min，95℃预变性10 min，95℃变性15 s，退火60℃30 s，40个循环。

以GAPDH为内参，校正每个样品的Ct值(每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数)，得ΔCt值。以2－ΔΔCt法计算各组间mRNA的表达量。ΔΔCt=各组(Ct目的基因－CtGAPDH)－对照组(Ct目的基因－CtGAPDH)，2－ΔΔCt=各组基因表达量/对照组基因表达量。

2.6Western blot检测大鼠脑组织Bcl-2、Neun、NGF、BDNF、Nogo-A、NgR的蛋白表达提取总蛋白，采用SDS-PAGE垂直板全湿法电泳，总蛋白经SDS-PAGE分离后，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜，用封闭液封闭2 h后加入稀释的一抗(Bcl-2多克隆抗体1∶600，Neun单克隆抗体1∶500，NGF多克隆抗体1∶1 000，BDNF多克隆抗体1∶1 000，Nogo-A多克隆抗体1∶800，NgR多克隆抗体1∶1 000，β-actin单克隆抗体1∶3 000 )，4℃下孵育过夜，次日TBS洗3遍，每次10 min，加入1∶1 000稀释HRP标记的第二抗体，室温下孵育2 h后TBS洗膜。之后加ECL显色剂经凝胶成像分析系统检测，分析目标条带的灰度值，以目标蛋白与β-actin的灰度值比值作为目标蛋白的相对量，并统计各组之间的差异。

2.7统计学分析用SPSS 18.0统计软件进行分析，数据以±s表示，除了神经损伤评分分析(非参数检验，Mann-Whitney test)，其余各组数据间的差别用ANOVA方法分析。

3　结果

3.1红景天苷对MCAO大鼠神经功能损伤的影响与MCAO组比较，MCAO+ Sal组在d 4开始能够有效降低神经功能损伤(n=12)，且差异具有显著性(Fig 1)。

3.2红景天苷对MCAO大鼠脑组织Nissl阳性细胞数目及bcl-2蛋白表达的影响Nissl染色显示红景天苷给药d 6后，能够增加Nissl阳性细胞数目，即完整神经细胞的数目(Fig 2) ; Western blot结果表明红景天苷能够上调bcl-2的蛋白水平(Fig 3)，这些结果提示着红景天苷能够抑制细胞凋亡。

3.3红景天苷对MCAO大鼠脑组织Neun mRNA及蛋白表达的影响与sham组比较，MCAO组Neun mRNA及蛋白表达明显降低;与MCAO组比较，红景天苷给药d 6后，能够提高Neun mRNA及蛋白表达，且差异具有显著性(Fig 4)。

3.4红景天苷对MCAO大鼠脑组织NGF、BDNF的蛋白表达的影响与sham组比较，MCAO组大鼠脑组织NGF、BDNF的蛋白达明显降低;与MCAO组比较，红景天苷给药d 6后，能够提高大鼠脑组织NGF、BDNF的蛋白表达，且差异具有显著性(Fig 5)。

Fig 1 Effects of salidroside treatment on neurologicalscore in MCAO rats(n=12)

Fig 2 Nissl-stained cells in ischemic brain(±s，n=6)

Fig 3 Effects of salidroside treatment on Bcl-2 protein in ischemic brain(n=3)

Fig 4 Effects of salidroside treatment on Neun mRNA (A) and protein (B) in ischemic brain(n=3)

3.5红景天苷对MCAO大鼠脑组织Nogo-A及其受体NgR mRNA及蛋白表达的影响与sham组比较，MCAO组大鼠脑组织Nogo-A及其受体NgR mRNA及蛋白表达明显升高;与MCAO组比较，红景天苷给药d 6后，能够降低大鼠脑组织Nogo-A及其受体NgR mRNA及蛋白表达且差异具有显著性(Fig 6，7)。

4　讨论

本研究发现红景天苷能够促进MCAO模型大鼠Bcl-2、Neun、NGF、BDNF的蛋白表达水平。Bcl-2是细胞死亡的负调因子，在细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡。NeuN是一种稳定而敏感的成熟神经细胞特异抗原的标记物，是神经组织特异的蛋白，参与神经系统的发育、分化和功能，在局灶性脑缺血的研究中应用较多［7］。同时，神经细胞的存活及维持其正常功能依赖于神经营养因子，而NGF，BDNF是神经营养因子家族中的重要成员［8］，NGF是神经营养因子中最早被发现，具有神经细胞营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节因子，它对中枢及周围神经细胞的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用; BDNF是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经细胞的存活、分化、生长发育起重要作用，并能防止神经细胞受损伤死亡、改善神经细胞的病理状态、促进受损伤神经细胞再生及分化等生物效应，也是成熟的中枢及周围神经系统的神经细胞维持生存及正常生理功能所必需。

Fig 5 Effects of salidroside treatment on BDNF(A)，NGF(B) in ischemic brain(n=3)

Fig 6 Effects of salidroside treatment on Nogo-A mRNA (A)and protein (B) in ischemic brain(n=3)

Fig 7　Effects of salidroside treatment on NgR mRNA (A) and protein (B) in ischemic brain(n=3)

脑内促进与抑制神经生长因子共同调控着轴突的生长。Nogo-A是目前已知主要的轴突生长抑制因子，具有最强的抑制神经生长的作用，而Nogo-A受体NgR介导了这一作用［9］。近年来，人们对Nogo-A及其受体NgR的结构及功能进行了大量研究，有了更为深入的了解。有研究表明［10］，调控Nogo-A及其受体NgR可影响脑缺血的发展和结果。本研究发现，红景天苷能够抑制Nogo-A及其受体NgR的基因和蛋白表达，改善轴突生长的微环境。

综上所述，红景天苷能够降低MCAO模型大鼠神经功能损伤，增加Nissl阳性细胞数目，提高Neun的表达，具有神经保护作用，此作用是通过促进抗凋亡因子Bcl-2及神经营养因子NGF、BDNF的表达，下调轴突生长抑制因子Nogo-A及其受体NgR的表达所实现。

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Neuroprotective effects of salidroside against focal celebral ischemia/reperfusion injury in rats

LAI Wen-fang1，2，ZHANG Xiao-qin1，HONG Hai-mian1，XIE Xiu-li1，HONG Gui-zhu1
(1.College of Pharmacy，2.Academy of Integrative Medicine，Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou 350122，China)

Abstract:AimTo investigate the effect of Salidroside on the focal celebral ischemia/reperfusion injury in rats and its underlying mechanism.Methods Adult male Sprague-Dawley rats，weighing 260-300 g，were randomly divided into three groups: sham，MCAO，MCAO+ salidroside(Sal) groups.The rats were subjected to local celebral ischemia reperfusion with suture-occluded method.The rats of MCAO+ Sal group were treated intraperitoneally with salidroside (50 mg ·kg(－1)) for 6 days.Neurological deficit testing was performed with Longa’s Scale.The mRNA expressions of Neun，Nogo-A，and NgR were detected by RT-qPCR in ischemic brain.The protein expressions of Neun，NGF，BDNF，Nogo -A and NgR were determined bybook=780,ebook=45Western blot.Results Compared with MCAO group，salidroside significantly improved the neurological deficit，promoted the expressions of Bcl-2，Neun，NGF，BDNF，and inhibited the expressions of Nogo-A，NgR.ConclusionSalidroside can reduce neurological deficit，increase the number of Nissl’s Body and the expression of Neun，and protect rats against focal celebral ischemia/reperfusion injury，which may be accomplished by increasing the expressions of Bcl-2，NGF，BDNF，and inhibiting the expressions of Nogo-A，NgR.

Key words:salidroside; focal celebral ischemia reperfusion; axonal growth inhibitors; nerve growth factor; neuroprotection; apoptosis

作者简介:赖文芳(1985－)，女，博士生，助理研究员，研究方向:药理学，E-mail:13559102126@163.com;洪桂祝(1966－)，女，博士，教授，研究方向:心脑血管药效药理学，通讯作者，E-mail: guizhuhong@ yahoo.co.uk

基金项目:国家自然科学基金资助课题(No 81473382) ;福建省科技厅重点项目(No 2014Y4004) ;福建省自然科学基金项目(No 2015J01328 ) ;福建中医药大学校管课题(No X2013010)

收稿日期:2015－02－08，修回日期:2015－03－07

文献标志码:A

文章编号:1001－1978(2015) 06－0775－06中国图书分类号: R-332; R284.1; R322.81; R743.310.531

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.008