兰科植物离体培养的研究进展

曹劼

（福建省　将乐县　林业局　353300）

兰科植物离体培养的研究进展

曹劼

（福建省将乐县林业局353300）

本文综述了近几年来兰科植物离体培养的研究现状，分析了目前存在的问题，并对兰科植物离体培养的前景进行展望。

兰科植物；离体培养；展望

1　兰科植物离体培养的研究现状

以下从兰科植物离体培养的外植体选取、培养基、植物激素、有机添加剂以及环境条件如温度、湿度、光照、酸碱度等方面进行综述：

1.1外植体选取

1.1.1茎尖

茎尖是植物细胞分裂最活跃的部位，也是较容易诱导和培育成功率较高的部位，是最早用于兰科植物快速繁殖的外植体。春兰、建兰、墨兰等均可用茎尖诱导出大量的类原球茎，然后类原球茎发育成根状茎后进一步成长为幼苗。研究表明，茎尖作为外植体更适合文心兰、大花蕙兰等复轴生长类型的兰花。李晓青等采用茎尖诱导原球茎的方法对大花蕙兰“瀑布”进行了初代离体培养，成功地诱导出原球茎并增殖分化出幼苗。

1.1.2种子

兰科植物的种子细小如粉，数量极多，其微小的种子本身不含胚乳和子叶，只有发育不完全的胚，储存在胚中的营养成分无法提供种子萌发所需要的有机养分，因而在自然条件下，种子萌发率很低。Link早在1824年就观察到自然条件下兰花种子萌发伴随着真菌感染的现象。1899年Bemard首次分离出兰花的根菌，并用其感染兰花的种子进行萌发试验，从而创立了共生萌发法。研究表明，大部分兰花种子都可以实现非共生萌发，即不需要任何真菌浸染就完成在人工培养基上萌发。随后，研究者用非共生萌发也对石斛兰、文心兰、蝴蝶兰等的种子进行萌发研究，取得了成功。之后，非共生萌发逐步代替了共生萌发，成为兰科植物组织培养的热点，兰科植物种子用于组织培养极富有前景。

1.1.3花梗

花梗在单茎性兰花组织培养中应用较多。以花梗作为兰花的外植体的最大优点在于获取原材料容易，消毒灭菌容易，也能保护母株免受更多的伤害，且能获得与母株优良性状一致的再生苗，但其也有不足之久，就是取材受到开花季节的限制。近几年来，关于利用蝴蝶兰花梗来诱导芽苗或类原球茎的增殖方式的研究较多。鲁雪华等的研究发现用蝴蝶兰花梗节间切段诱导频率比茎尖、根尖要高得多；李军等对蝴蝶兰组织培养的工厂化生产技术研究也是利用蝴蝶兰的花梗作为外植体的。卜朝阳等以蝴蝶兰花梗为外植体，诱导腋芽萌发并成功获得无菌苗。

1.1.4叶片

叶片是较为理想的外植体材料，既可以减少对母株的伤害，取材又不受到花季限制。其中试管苗的幼叶作为外植体进行培养效果最好。Kuo等利用蝴蝶兰试管苗研究了离体叶片诱导体细胞胚胎发生的过程，并通过类原球茎再生成苗。以试管苗幼叶为外植体经体细胞胚胎发生途径再生成苗试验的成功，不仅为兰科植物优良种苗的快速繁殖提供了有效途径，也为兰科植物转基因研究提供了很好的技术平台。

1.2培养基

植物培养基作为植物离体培养的核心技术，主要包括碳源、维生素、无机盐、生长调节剂、有机添加物构成，它供给和保障植物组织离体状态下良好生长的必要营养。在兰科植物离体培养中，最常用是MS、KC、VW、N6、White和他们的改良型。不同植物材料生长分化所需的营养条件各不相同，甚至同一植物不同部位的生长分化要求也各不同，因此在选用基本培养基时可根据不同品种和培养阶段加以修改。罗吉凤等比较了MS、1/2MS、1/ 2N6、White等培养基对铁皮石斛种子萌发的影响，结果发现，30d种子发芽率均达到95％，但是原球茎的直径存在差异，1/2MS培养基上所萌发的原球茎最大，说明1/2MS更利于种子萌发。江建铭等以金线莲的茎节段作为外植体，选用了MS、1/2MS、VW、B5和KC等5种培养基进行不定芽诱导，经60d的培养，MS、B5培养基中不定芽增殖率明显高于其它三种，结果表明MS、B5培养基更适合金线莲茎段不定芽诱导的基本培养基。

1.3植物激素

植物激素是影响植物离体形态发生的关键因素，控制着细胞生长、分化、发育等生理变化和形态形成，对诱导兰花原球茎、新植株体形成和兰花品种种子发芽至关重要。目前常使用的植物激素主要是IAA、NAA和2，4-D等生长素类和KT、ZT和BA等细胞分裂素类，适当浓度的生长素和细胞分裂素对愈伤组织的形成和芽的分化有促进作用。对不同的兰科植物来说，在不同的生长发育阶段所需激素的量及种类都不尽相同。在金线莲壮苗培养中，NAA对促进幼苗生长的影响比6-BA更为明显。郑亚琴[31]研究了植物激素对大花蕙兰繁殖系数的影响，发现繁殖系数不仅取决于激素的浓度，还取决于激素之间的比例，当NAA0.2mg/L、BA0.8-1.2mg/L时，大花蕙兰繁殖系数较高。

1.4有机添加物

有机添加物由于含有许多复杂、有效的成分而广泛应用于兰科植物的离体培养。离体培养中常用的有机添加物有椰子汁、香蕉、土豆和马铃薯等。李蕤等在研究香蕉泥、苹果汁、椰子汁3种添加物对霍山石斛幼芽生长影响的实验中发现，这3种添加物都能促进幼芽的生长，其中香蕉泥的效果最为明显。实验进一步研究了香蕉泥的添加量对幼芽生长的影响，结果表明香蕉泥对幼芽的诱导表现出添加量的临界点，超过临界量后不利于霍山石斛幼芽的生长。何松林等比较了蛋白胨、胰蛋白胨、苹果汁、番茄汁、椰子汁对文心兰原球茎增殖的影响，结果表明蛋白胨对文心兰原球茎的增殖效果最为显著，而胰蛋白胨、苹果汁和椰子汁对文心兰的幼苗分化影响较大。

1.5环境条件

光照强度对外植体的生长有一定的影响。兰花在接种初期根据不同种类大多维持黑暗或200～600lx的弱光，到类原球茎阶段后给予1000～2000lx的强度，长根壮苗阶段以2000～3000lx为好。大花蕙兰、金线莲等关于光照的研究都证明了这一点。Gow等的研究发现，光照时间越长，外植体褐变率越大，体细胞胚胎的发生率越低。培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，过酸或过碱都对植物材料生长有影响。兰花所用的培养基一般呈弱酸性，pH值在5.0～6.0，不同的种类对pH值的要求不同。蝴蝶兰原球茎在pH值5.0～5.4的环境中生长最好，丛生芽的诱导和增殖在pH值为5.6～5.8时较好。在pH值5.2～5.8范围内，霍山石斛有较高的出芽率，尤其是pH值为5.8时。

2　兰科植物离体培养过程中存在的问题

2.1污染的发生

污染主要有细菌性污染和真菌性污染两类，细菌性污染的表征为菌斑呈粘液状物，在接种1～2d即可发现，造成的原因一般由于材料带菌、培养基灭菌不彻底、操作人员的不当等。真菌性污染是指培养基表面货材料表面出现菌丝，继而很快形成不同颜色的霉菌，接种3～10d后才发现，多为周围环境的不清洁、培养用具的口径过大、超净工作台的过滤装置失效等造成。在兰科植物离体培养过程中，控制污染是关键，尤其在高温高湿的夏季污染相当高，可能会影响当季的生产计划，甚至造成品种的丢失。因此在离体培养过程中，尽量将有菌的物体经处理转化为无菌的物体，这是离体培养的关键所在。可以从外植体处理、培养基的灭菌、接种操作、接种室及培养室消毒等方面进行污染的控制。

2.2玻璃化现象

玻璃化是植物离体培养过程中的一种生理失调或生理病变，导致玻璃化苗的产生。在兰科植物离体培养中，玻璃化现象表现为原球茎透明，含水量高、分化能力降低，试管苗出现茎节多、根多、叶片厚而脆、组织畸形、生长缓慢、移栽成活率低等问题。朱晋云等对大花蕙兰离体培养两年多的研究工作证实了这一点。邓小果等在文心兰的组织培养过程中也发现了玻璃化现象。植物试管苗玻璃化是组培过程中的三大难题之一，给科研和生产造成极大损失。因此，在实际生产过程中必需采取降低兰科植物试管苗的玻璃化现象，直至消除玻璃化现象。

2.3褐化现象

克服外植体褐化的措施主要从这几个方面入手。但是对于不同的兰科植物材料，降低和防止褐化现象的具体方法有所不同。在对秦岭野生春兰组织培养过程中的褐化控制研究中发现，以1/2MS为基本培养基，加入活性炭1g/L，PVP5g/L，pH5.4，在外植体接种初期暗培养10d对减轻外植体褐化最为有效。为减少石斛兰的褐化现象，陈亚鸿等采取了提高培养基的pH值，添加活性炭以及胰蛋白胨等措施，取得了不错的成果。尤海波等对解决蝴蝶兰外植体褐化问题的研究表明，采用带腋芽的、抽4节的花梗为外植体，用表面活性剂（Tweens20）20×10-6处理10min、70％酒精浸泡30s、0.5％的次氯酸钠溶液浸泡5min的方法消毒外植体减轻褐化的效果最佳；培养基中添加10mg/LAA和1000mg/L PVP抗褐化效果较好，在诱导阶段采用低浓度蔗糖诱导可减少褐化现象的发生。

2.4遗传变异

植物离体培养的重要目的在于保存种质资源，避免基因的丢失和毁灭，快速繁殖具有价值的花卉苗木。大多数兰科植物是珍稀濒危植物，具有很高的观赏价值、药用价值和科研价值，如果培养过程中遗传变异率太高，不仅不能为保存资源和培育优良的品种提供基础保障，还会严重影响到工厂化生产。兰科植物的遗传变异是一个非常复杂的问题，引起遗传变异的因素相当多，主要是植株体的基因型、培养环境以及继代次数。因此，在兰科植物离体培养过程中，应尽量选择遗传稳定性好的基因型；协调好培养基中的营养元素；选用适合的激素种类和浓度，减少或不使用易引起诱变的物质；控制好培养温度、湿度和光照；减少继代次数以降低遗传变异现象的发生率。

2.5成本高

兰科植物离体培养过程，不仅继代增殖次数多，而且周期长，消耗了大量的人力、物力和原材料，生产成本相对较高。成本直接影响商品的竞争力，所以只有降低成本，离体培养才有生命力。因此，在离体培养过程中应在保证苗的质量的情况下尽量降低成本。在培养基方面，可用低成本物质代替一些高成本的物质，比如用白砂糖代替蔗糖等。同时，减少培养过程中的损失，如玻璃化现象、污染、褐化现象等，都可以有效降低成本。另外多查阅相关文献，参考前人的经验，可以少走弯路，减少资源的浪费。

3　展望

目前，兰科植物的离体培养技术已经取得较大进展，但仍有很多技术急需改进和发展。如试管苗移栽后生长缓慢和开花迟的瓶颈研究，可采用人工改造生长环境的方法研究光照强度、温湿度、栽培基质等长生因子对国兰生长发育的影响；可以提取药用成分为研究目的，通过优化培养基成分和生长条件，以提高次生代谢物的含量，寻找最优的培养条件，由离体培养组织到直接生产药用活性成分；可借助于其它栽培繁育手段结合离体培养技术进行多方位育种，研究如何提高离体培养苗的移栽成活率；同时也可将离体培养技术与物理诱导、化学诱导、基因转化等技术结合相融合，为培育符合大众审美观的兰花新品种奠定理论和技术基础。特别是野生珍稀兰科植物要重点保护，禁止滥采，这样才能保证兰科植物种质资源的可持续发展。

S682.31

A

1673-0038（2015）27-0251-02

2015-6-10