马钱子与白术配伍对关节炎大鼠免疫机制研究*

梁晓东，陈 涛，唐迎雪△，曹永仓

(1．山东中医药大学基础医学院，济南 250355;2．泰安市中医医院院办公室，山东泰安 271000)

马钱子与白术配伍对关节炎大鼠免疫机制研究
*

梁晓东1，陈 涛2，唐迎雪1△，曹永仓2

(1．山东中医药大学基础医学院，济南 250355;2．泰安市中医医院院办公室，山东泰安 271000)

目的:探讨马钱子与白术配伍(简称马术)防治佐剂性关节炎(AA)大鼠的免疫机制。方法:建立AA大鼠模型，将马钱子与白术不同配比水煎剂连续灌胃给药32d，取血和滑膜组织观察滑膜组织病理形态学变化，血清中风湿因子(RF)、白介素-1β、-6、-10(IL-1β、IL-6、IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、循环免疫复合物(CIC)、C型反应蛋白(CRP)和滑膜组织中前列腺素E2(PGE2)、皮质醇(Cor)的变化。结果:配伍组能不同程度地改善滑膜组织充血、坏死、炎细胞浸润、纤维组织增生，降低RF、IL-1β、IL-6、CIC、CRP、Cor的含量。结论:马术防治AA的免疫机制为抑制炎性细胞因子和Cor，控制炎症反应，其较佳配比为1∶6。

马钱子配伍白术;佐剂关节炎;细胞因子;免疫机制

马钱子味苦性温，具有通络止痛、散结消肿之功［1］，广泛用于风湿痹症及偏身麻木，其疗效显著确切，为历代医家所推崇。张锡纯曰:“马钱子开通经络，透达关节之力远胜于它药。”合理配伍既是中医治病的一大特色，又是增强疗效、控制药物毒性的重要途径之一。古今医家将马钱子与白术配伍治疗关节炎颇有效验，抗炎止痛效果良好且无马钱子中毒现象。笔者通过前期实验研究发现，两者配伍可有效减轻AA大鼠足跖肿胀程度和炎症反应，保护免疫器官，并可改善自由基损伤［2］。本研究旨在通过观察给药后佐剂性关节炎(AA)大鼠血清细胞因子和滑膜组织中PGE2、Cor的变化，进一步探讨两者防治AA的免疫机制，以冀对临床合理应用马钱子治疗类风湿关节炎(RA)提供科学依据。

1 材料

1.1 中药材

制马钱子为马钱科植物马钱 Strychnos．nuxvomicaL．的成熟种子，砂烫法炮制，产于广西。生白术为菊科植物白术 Atractylodesmacrocephala Koidz的干燥根茎，产于浙江。以上中药材购于山东中医药大学中鲁医院，经本校中药鉴定教研室李峰教授鉴定，符合2010年版《中华人民共和国药典》［1］标准。

1.2 制剂制备

马钱子单煎剂:称取马钱子20g，加8倍量蒸馏水浸泡1h，武火煮沸30min，用双层纱布过滤，得滤液I;药渣再加6倍量蒸馏水，武火煮沸20min，同上法过滤，得滤液II;合并滤液I、II，65℃恒温水浴浓缩至每ml制剂含马钱子0.25g(以马钱子生药量计算)，灭菌4℃冰箱保存备用。马术1∶2煎剂:分别称取马钱子20g、白术40g，制备方法同上。马术1∶4、1∶6煎剂:制备方法同上。

1.3 试剂

10%水合氯醛(上海化学试剂公司，批号20100125);弗氏完全佐剂(美国 Sigma公司，批号038K8726CAS9007-81-2);IL-1β测试盒(批号28C037)、IL-6测试盒(批号46E029)、IL-10测试盒(批号12A021)、TNF-α测试盒(批号012A38)均为美国R＆D公司产品;PGE2测试盒(批号31QW21)、Cor测试盒(批号 68RT71)、CIC测试盒(批号031X05)、CRP测试盒(批号 98R056)均为瑞士Bachem公司产品。

1.4 仪器

GL20A全自动高速冷冻离心机(湖南仪器仪表总厂离心机厂);SZ-1快速混匀器(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂);UltraFreeze超低温冰箱(丹麦Heto公司);EL340i全自动酶标仪(赛默飞世尔上海仪器有限公司)。

1.5 动物及分组

SPF级Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量(200±20)g。性别、体质量按随机数字表法分为空白组、模型组、马钱子单煎剂组、马术1∶2、1∶4、1∶6煎剂组6组，每组10只，动物由山东鲁抗医药股份有限公司提供(许可证号SCXK(鲁)20050017)。空白组、模型组给予等容量生理盐水，其余各组均给予相应煎剂110mg/kg(以2010年版《中华人民共和国药典》规定马钱子内服最大剂量0.6g为准，按人与大鼠间药物剂量换算)。

2 方法

2.1 建立AA模型

除空白组外，从实验开始第1天各组大鼠分别从每只大鼠右后足垫部皮下注入弗氏完全佐剂(CFA)0.1ml(0.25ml注射器，专人注射，保持剂量准确及部位一致)，建立AA大鼠模型。

2.2 取血

实验从第32天的21∶00禁食不禁水12h，第33天全部大鼠称重，用水合氯醛腹腔注射麻醉1ml/ 100g，经腹主动脉采血静置1h，4000rpm/min离心10min，分离血清。

2.3 滑膜组织取材

取下右膝关节，打开膝关节腔，沿关节正中纵行切开皮肤，暴露出以膝关节为中心的约3×3cm2区域，用齿镊提起髌骨，沿髌骨上沿约0.3～0.4cm处向下切至股骨，再分别沿髌骨两侧向下分离至胫骨，由髌骨下极向上延续有一层平滑光亮呈淡黄色的滑膜组织，完整剥离滑膜组织，用刀片完整切下。称重后以1.5ml生理盐水于冰浴中匀浆滑膜组织，将匀浆液2000rpm离心10min，取上清液待测。

2.4 马钱子配伍白术对AA大鼠血清细胞因子的影响

取血清采用Elisa法，操作严格按照试剂盒说明书进行。在微孔中将标准品按每孔各100μL，再依次加入100μL处理后的待测样品，除空白对照孔外加入50μL酶标记物充分混匀。将包被微孔板覆膜或加盖放置在37℃孵育反应60min后，充分弃尽孔内液体并扣干孔内剩余残液，用预先稀释好的清洗液反复冲洗5次。除空白对照孔外，每孔加入酶标抗体50μL，将包被微孔板覆膜或加盖，37℃孵育60 min洗板、拍干。包括空白对照孔在内，每孔依照次序先加入底物Ⅰ50μL，再加入底物Ⅱ50μL充分混匀。在室温下避光反应15min。反应过后每孔分别加入终止液50μL充分混匀，终止反应。分别检测风湿因子(RF)、白介素-1β、-6、-10(IL-1β、IL-6、IL-10)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、循环免疫复合物(CIC)、C型反应蛋白(CRP)。

2.5 马钱子配伍白术对AA大鼠滑膜组织病理形态学的影响

取滑膜组织，放入10%甲醛溶液中固定后进行脱钙处理，常规梯度脱水、浸蜡、包埋、切片，用于HE染色。

2.6 马钱子配伍白术对AA大鼠滑膜组织中滑膜组织中前列腺素E2(PGE2)、皮质醇(Cor)含量的影响

滑膜组织匀浆取上清，采用Elisa法，操作严格按照试剂盒说明书进行。

2.7 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差(±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 马钱子配伍白术对AA大鼠血清细胞因子的影响

模型组、马钱子单煎剂组大鼠血清中RF、IL-1β、IL-6、TNF-α、CIC、CRP含量较空白组明显增高，IL-10含量降低(P＜0.05或P＜0.01);马术1∶2煎剂组能降低大鼠血清中RF、IL-6、CRP含量(P＜0.05或P＜0.01)，马术1∶4、1∶6煎剂组可显著降低RF、IL-1β、IL-6、TNF-α、CIC、CRP含量(P＜0.05或P＜0.01)。

3.2 马钱子配伍白术对AA大鼠滑膜组织病理形态学的影响

图1～6显示，模型组大鼠滑膜组织充血、坏死、增厚明显，炎细胞浸润，纤维组织增生。马钱子单煎剂组和马术1∶2煎剂组滑膜组织增厚，上皮细胞可见坏死和淋巴细胞充血。马术1∶4煎剂组滑膜增厚，局部炎性细胞浸润明显;马术1∶6煎剂组滑膜略显增厚，局部出现炎细胞浸润。

3.3 马钱子配伍白术对 AA大鼠滑膜组织PGE2、Cor含量的影响

模型组、马钱子单煎剂组大鼠滑膜组织中PGE2、 Cor含量较空白组明显增高;与模型组比较，马术1∶4、1∶6大鼠血清中Cor的含量降低(P＜0.05)。

表1 马钱子配伍白术对AA大鼠血清细胞因子的影响(±s)

表1 马钱子配伍白术对AA大鼠血清细胞因子的影响(±s)

注:与空白组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与马钱子单煎剂组比较:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组 别鼠数剂量(mg/kg) RF (pg/ml) IL-1β (ng/ml) IL-6 (ng/L) IL-10 (pg/ml) TNF-α (ng/L) CIC (ng/ml) CRP (ng/ml)空 白 组 10 — 37.69±3.72 0.15±0.05 52.22±22.65 136.11±18.06 126.43±62.11 0.71±0.19 147.55±21.85模 型 组 10 — 86.27±4.29＊＊ 0.23±0.03＊＊ 84.86±12.05＊＊ 105.29±15.39＊＊ 281.46±103.05＊＊ 1.35±0.37＊＊ 224.96±44.93＊＊马钱子单煎剂 10 110.0 65.33±4.61＊△ 0.21±0.03＊＊ 74.95±26.40＊＊ 103.30±28.16＊＊ 250.73±97.45＊＊ 1.12±0.30＊＊ 179.52±27.54＊△马术1∶2煎剂 10 110.0 64.44±6.37△ 0.19±0.04 67.01±13.86△ 74.85±20.63＊＊△△▲▲ 226.95±107.28* 1.13±0.27＊＊ 150.55±42.15△△▲马术1∶4煎剂 10 110.0 46.28±8.53△△▲▲ 0.16±0.07△△▲ 49.49±15.64△△▲▲ 59.85±16.42＊＊△△▲▲ 233.29±88.17＊＊ 1.04±0.22＊＊△ 175.64±72.43△马术1∶6煎剂 10 110.0 42.57±6.23△△▲▲ 0.16±0.05△△▲▲ 46.44±12.01△△▲▲ 85.49±21.91＊＊△ 144.19±50.58△△▲ 0.99±0.21＊△△ 141.57±31.59△△▲

图1 空白组滑膜组织(×200)

图2 模型组滑膜组织(×200)

图3 马钱子组滑膜组织(×200)

图4 马术1∶2组滑膜组织(×200)

图5 马术1∶4组滑膜组织(×200)

图6 马术1∶6组滑膜组织(×200)

4 讨论

RA中的细胞因子参与炎症的全过程，在加重炎性反应或促使炎症修复及炎症慢性化方面起到重要作用。其中，IL-1、TNF-α可促进滑膜细胞和淋巴细胞的分化和增殖，促使两者合成并释放前PGE2和胶原酶。PGE2和胶原酶可诱导滑膜炎症反应、疼痛和骨关节破坏。而局部的CIC、游离的胶原等分解产物又会刺激IL-1的合成，这样形成一个恶性循环［3-4］。这2种细胞因子进而可刺激滑膜成纤维细胞增生，分泌产生IL-6等趋化因子，IL-6可强力诱导急性期反应蛋白和自身抗体产生，如CRP和RF［5］。IL-10是RA病变过程中具有抗炎、免疫抑制及免疫调节的重要细胞因子，可抑制核细胞分泌多种细胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-3和GM-CSF等［6-7］。

表2 马钱子配伍白术对AA大鼠滑膜组织PGE2、Cor的影响(±s)

表2 马钱子配伍白术对AA大鼠滑膜组织PGE2、Cor的影响(±s)

注:与空白组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05，△△P＜0.01;与马钱子单煎剂组比较:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别鼠数 剂量(mg/kg) PGE2(ng/ml) Cor (ng/ml)空 白 组10 —0.42±0.10 37.16±16.27模 型 组 10 — 0.64±0.19＊＊ 84.07±33.64*马钱子单煎剂 10 110.0 0.52±0.16 62.75±41.71马术1∶2煎剂 10 110.0 0.64±0.15＊＊ 44.99±19.63马术1∶4煎剂 10 110.0 0.58±0.14* 36.93±10.37△马术1∶6煎剂 10 110.0 0.65±0.14＊＊ 35.29±11.40△△

本研究结果表明，马术煎剂可不同程度改善滑膜组织增生、炎症、坏死、炎细胞浸润，且改善程度与白术的剂量成正比，说明药物间的协同增效作用与药物的比例有关，同样的配伍运用不同的剂量比例后可能在质或量上产生不同的化学和药理效应。究其机制，马术1∶2煎剂组大鼠给药后RF、IL-6、IL-10、CRP的含量有所降低，马术1∶4煎剂组RF、IL-1β、IL-6、IL-10、CRP、CIC、Cor含量降低明显，马术1∶6煎剂组RF、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、CRP、CIC、Cor含量降低明显，说明马术通过降低 IL-1β和TNF-α含量，减少对滑膜成纤维细胞的刺激，进而减少IL-6的分泌，使RF、CIC、CRP含量降低，起到抑制细胞因子、从而减轻AA大鼠炎症、组织损伤、软骨与骨的破坏作用。Cor含量降低，说明马术1∶4、1∶6煎剂能有效抑制致炎细胞因子的产生，调整Cor分泌紊乱，使其对细胞因子的负反馈调节作用重新建立，延缓AA病情的发展。研究结果说明，马钱子配伍白术对AA大鼠炎症具有靶点的免疫抑制作用，提示临床应用马钱子治疗RA可配伍一定比例的白术。

［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典［M］．北京:国家药典委员会出版社，2010:34．

［2］ 梁晓东．马钱子-苏木与马钱子-白术配伍减毒增效及治疗痹症机理的研究［D］．山东中医药大学，2012:3．

［3］ Vuolteenahok，MoilanenT，HamalainenM，etal．Regulationof nitricoxideproductioninosteoarthriticandtheumatiodcartilage: RoleofendogenousIL-1inhibitors［J］．ScandRheumatol，2003，32(1):19-24．

［4］ 陈良东，林洁，周剑波，类风湿关节炎患者血清IL-17、IL-18、IL-6和TNF-α检测的意义［J］．当代医学，2010，16(7):13-14．

［5］ NorihiroNishim．Cytokinesignalregulationandautoimmune disorders［J］．Autoimmunity，2005，38(5):359-367．

［6］ MooreKW，deWaalMalefytR，CoffmanRL，etal．Interleukin-10 andtheinterleukin-10receptor［J］．AnnuRevImmunol，2001，19:683-765．

［7］ CharbonnierLM，HanWG，QuentinJ，etal．Adoptivetransferof 1L-10-secretingCD4+CD49b+regulatoryTcellssuppresseson goingarthritis［J］．JArtoimmum，2010，34(4):390-399．

StudyontheCompatibilityofNuxVomicaandBaizhuonImmune MechanisminRatswithArthritis

LIANGXiao-dong1，CHENTao2，TANGYing-xue1△，CAOYong-cang2
(1．ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，CollegeofBasicMedicine，ShandongJi'nan250355，China; 2．Tai'anHospitalofTraditionalChineseMedicine，TheHospitalOffice，ShandongTai'an271000，China)

Objective:TodiscusstheimmunemechanismofAdjuvantArthritis(AA)ratwithcompatibilityofNux vomicaandAtractylodes，andfindthebetterratio．Methods:EstablishingAAratmodel，andgivingthedifferentratiowater decoctionin32dcontinuouslybygavage，takingbloodandsynovialtissue，observingthechangesofinterleukin-1β，-6，10 (IL-1β、IL-6、IL-10)，tumornecrosisfactor(TNF-α)，circulatingimmunecomplex(CIC)，Creactiveprotein(CRP)in serumandprostaglandinE2(PGE2)andcortisol(Cor)inthesynovialtissue．Results:Thecompatibilitycanobviously reducethecontentofIL-1β、IL-6、CIC、CRP、Cor．Conclusion:ThemechanismofpreventingAAiscontrollingthecontent ofinflammatorycytokinesandinflammation，anditsbetterratiois1∶6．

CompatibilityofNuxvomicaandAtractylodes;Adjuvantarthritis;Cytokines;Immunemechanisms

R285．5

:B

:1006-3250(2015)08-0949-03

2015-02-14

高等学校博士学科点专项科研基金(200804410002)

梁晓东(1981-)，男，讲师，医学博士，从事中药理论及复方药理毒理研究。

△通讯作者:唐迎雪，Tel:0531-89628067，E-mail:doctoryxt@ sina．com。