自拟中药煎剂对糖尿病足模型大鼠的影响

郗玉玲，王涛，邓智建

(新乡医学院第一附属医院，河南 新乡 453100)

糖尿病足(Diabetic Foot，DF)是指由于合并神经病变以及不同程度的末梢血管病变等导致的下肢功能减退，溃疡或坏疽等深部组织的破坏。作为糖尿病的一种严重慢性并发症，DF已经成为糖尿病患者肢体残疾、能力丧失甚至死亡的重要原因。DF的发生机制大致可分为神经病变、缺血性血管病变、足部感染等，其中血管病变是糖尿病患者截肢的主要危险因素[1-2]。血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)与血管内皮功能的改变密切相关，参与DF的发生发展[3]。本实验拟制备DF溃疡模型大鼠，采用自拟中药煎剂治疗，观察VEGF等指标变化，评价其对DF的治疗作用，为其临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

无特定病原体(Specified Pathogen Free，SPF)级6～8周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠90只，体质量180～200 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2012-0001，随机取10只作为正常对照组，其余80只采用高糖高脂饲料(20%蔗糖、18%猪油、3%蛋黄和59%基础饲料)喂养4周，禁食12 h后腹腔注射STZ 40 mg/(kg·d)，制备2型糖尿病模型大鼠。成功造模大鼠采用薄铁片按压联合冰醋酸制备DF溃疡模型，因造模过程中足部感染等原因死亡20只，故成功制备DF溃疡模型大鼠60只，随机分为中药煎剂原液组(高剂量)、1∶1稀释组(中剂量)和1∶2稀释组(低剂量)、二甲双胍[100 mg/(kg·d)]组和模型对照组，每组10只。

1.2 药品、试剂及仪器

中药煎剂(自拟)：由黄芪、四季青、赤芍、三七、蜈蚣、血竭、土鳖虫组成(北京同仁堂股份有限公司)，以8倍水量浸泡20 min，煎煮20 min，2次，合并滤液，浓缩至3 000 g/L，备用；盐酸二甲双胍片(北京市永康药业有限公司，批号15051278)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司，批号B64927)；大鼠血管内皮细胞生长因子(VEGF)ELISA试剂盒(Ratts Vascular Endothelial cell Growth Factor,VEGF ELISA kit )(上海索宝生物技术有限公司，批号201510、201508)；超越JPS-7型血糖测定仪及C18型血糖试条(北京怡成生物电子技术有限公司)；7180型自动生化分析仪(日本株式会社日立高新技术)；Multiskan MK3酶标仪(美国Thermo公司)；LBY-N6COMPACT全自动血液流变仪(北京普利生仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠糖尿病模型制备

模型组大鼠禁食12 h后腹腔注射STZ 40 mg/(kg·d)，连续2日，超越JPS-7型血糖测定仪测大鼠尾静脉血糖，第3天血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠模型造模成功。

1.3.2 糖尿病大鼠足部溃疡模型制备

以薄铁片连续按压结合冰醋酸连续涂抹的方式制备足部溃疡模型[4]，出现不同程度的下肢红肿、溃疡、坏疽等改变，根据下肢DF症状进行 Wagner评分[5]。

1.3.3 各组大鼠给药处理情况

每日上午9时二甲双胍组灌胃1次，其他各给药组按上述浓度煎剂浸泡左后足30 min，每天1次，模型对照组大鼠以等量蒸馏水浸泡30 min，每天1次，连续3周。

1.4 观察指标

1.4.1 下肢溃疡症状评分

肢端坏疽情况根据Wagner分类原则[5]。1分：皮肤无开放性病灶，表现为肢端颜色紫绀或苍白；2分：肢端皮肤有浅表的开放性病灶；3分：感染病灶侵犯深部肌肉组织；4分：肌腿韧带组织破坏，但骨质破坏尚不明显；5分：严重感染已造成骨质破坏、骨髓炎、骨关节破坏或已形成假关节；6分：足的大部或全部感染或缺血，导致严重的湿性或干性坏疽。给药前及给药后第1、2、3周末对各给药组及模型组大鼠四肢肢端坏疽程度进行评分，计算每只大鼠的总积分。

1.4.2 进食量与饮水量测定

每天上午8点测量各组大鼠的进食量和饮水量，计算各组大鼠给药前及给药后第1、2、3周每只动物的平均进食量和饮水量。

1.4.3 空腹血糖测定

于DF溃疡模型制备成功后即给药前及给药后第1、2、3周末，禁食12 h，大鼠尾静脉取血100 μl，采用虹吸法利用超越JPS-7型血糖测定仪测大鼠尾静脉血糖。

1.4.4 血液流变学指标测定及血清VEGF水平测定

给药后第3周末对大鼠禁食12 h后，用10 g/L戊巴比妥腹腔注射麻醉后剖腹，腹主动脉穿刺取血约10 mL，取3 mL注人含肝素钠抗凝试管中，混匀，用作血液流变学检测，其余血注入试管中凝固后离心，分离血清，低温冰箱-80℃冻存备用。利用全自动血液流变仪测定全血黏度高切、中切、低切、血浆黏度及红细胞压积、红细胞流变特性等。 按试剂盒说明书方法采用双抗体夹心ELISA法测定血清VEGF水平。方法如下：1)将特异性抗体与固相载体相连，形成固相抗体；2)加受检标本即大鼠血清与固体抗体接触一段时间，使标本中的抗原与固相载体中的抗体结合，形成固相抗原复合物，洗涤除去未结合的物质；3)加酶标抗体，使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，洗涤酶标抗体；4)加底物，根据颜色反应的程度进行抗原的定性和定量。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠给药前后下肢溃疡症状评分比较

给药前各给药组及模型对照组大鼠下肢溃疡症状评分均显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；各给药组及模型对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

给药后1、2周，模型组及给药组下肢溃疡症状评分均显著高于正常对照组(P<0.05)；正常对照组、中药煎剂中、高剂量组、二甲双胍组均显著低于模型对照组(P<0.05)；正常对照组，中药煎剂中、高剂量，二甲双胍组显著低于中药煎剂低剂量组(P<0.05)；正常对照组显著低于中药煎剂中、高剂量组及二甲双胍组(P<0.05)，模型组及中药煎剂低剂量组显著高于中药煎剂中、高剂量组及二甲双胍组(P<0.05)；中药煎剂中、高剂量组与二甲双胍组间比较无显著性差异(P>0.05)。

给药后3周，模型组及给药组下肢溃疡症状评分均显著高于正常对照组(P<0.05)；正常对照组及各给药组均显著低于模型对照组(P<0.05)；正常对照组及各给药组、模型对照组均显著低于中药煎剂低剂量组(P<0.05)；正常对照组显著低于中药煎剂中、高剂量组及二甲双胍组(P<0.05)，模型组及中药煎剂低剂量组显著高于中药煎剂中、高剂量组及二甲双胍组(P<0.05)；中药煎剂中、高剂量组与二甲双胍组比较无显著性差异(P>0.05)。结果见表1。

表1 各组大鼠给药前后DF评分比较

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与中药煎剂低剂量组比较，cP<0.05；与中药煎剂中剂量组比较，dP<0.05；与中药煎剂高剂量组比较，eP<0.05

2.2 对大鼠饮水量、进食量的影响

给药前各给药组及模型对照组大鼠药前饮水量及进食量均显著高于正常对照组(P<0.05)，差异有统计学意义；各给药组较模型对照组无显著性差异(P>0.05)。

给药后1、2周，模型组及给药组饮水量及进食量均显著高于正常对照组(P<0.05)；正常对照组、中药煎剂中、高剂量组、二甲双胍组均显著低于模型对照组(P<0.05)；正常对照组，中药煎剂中、高剂量，二甲双胍组显著低于中药煎剂低剂量组(P<0.05)；正常对照组显著低于中药煎剂中、高剂量组及二甲双胍组(P<0.05)，模型组及中药煎剂低剂量组显著高于中药煎剂中、高剂量组及二甲双胍组(P<0.05)；中药煎剂中、高剂量组与二甲双胍组比较无显著性差异(P>0.05)。

药后3周，模型组及给药组饮水量及进食量均显著高于正常对照组(P<0.05)；正常对照组及各给药组均显著低于模型对照组(P<0.05)；正常对照组及各给药组、模型对照组均显著低于中药煎剂低剂量组(P<0.05)；正常对照组显著低于中药煎剂中、高剂量组及二甲双胍组(P<0.05)，模型组及中药煎剂低剂量组显著高于中药煎剂中、高剂量组及二甲双胍组(P<0.05)；中药煎剂中、高剂量组与二甲双胍组比较无显著性差异(P>0.05)。见表2～3。

表2 给药1、2、3周各组大鼠饮水量比较

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与中药煎剂低剂量组比较，cP<0.05；与中药煎剂中剂量组比较，dP<0.05；与中药煎剂高剂量组比较，eP<0.05

表3 给药1、2、3周各组大鼠进食量比较

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与中药煎剂低剂量组比较，cP<0.05；与中药煎剂中剂量组比较，dP<0.05；与中药煎剂高剂量组比较，eP<0.05

2.3 对DF溃疡大鼠血糖的影响

给药前各给药组及模型对照组大鼠药前血糖值均显著高于正常对照组(P<0.01)，差异有统计学意义；各给药组较模型对照组无显著性差异(P>0.05)。

给药后1、2周，模型组及给药组血糖均显著高于正常对照组(P<0.05)；正常对照组,中药煎剂中、高剂量组、二甲双胍组均显著低于模型对照组(P<0.05)；正常对照组，中药煎剂中、高剂量组，二甲双胍组显著低于中药煎剂低剂量组(P<0.05)；正常对照组显著低于中药煎剂中、高剂量组及二甲双胍组(P<0.05)，模型组及中药煎剂低剂量组显著高于中药煎剂中、高剂量组及二甲双胍组(P<0.05)；中药煎剂中、高剂量组与二甲双胍组比较无显著性差异(P>0.05)。

给药后3周，模型组及给药组血糖均显著高于正常对照组(P<0.05)；正常对照组及各给药组均显著低于模型对照组(P<0.05)；正常对照组及模型对照组均显著低于中药煎剂低剂量组(P<0.05)；正常对照组显著低于中药煎剂中、高剂量组及二甲双胍组(P<0.05)，模型组及中药煎剂低剂量组显著高于中药煎剂中、高剂量组及二甲双胍组(P<0.05)；中药煎剂中、高剂量组与二甲双胍组比较无显著性差异(P>0.05)。见表4。

表4 给药1、2、3周各组大鼠血糖变化情况比较

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与中药煎剂低剂量组比较，cP<0.05；与中药煎剂中剂量组比较，dP<0.05；与中药煎剂高剂量组比较，eP<0.05

2.4 对DF部溃疡大鼠血液流变学的影响

给药前模型对照组大鼠全血黏度高、中、低切及红细胞聚集数均显著高于正常对照组(P<0.05)；各给药组显著低于模型对照组(P<0.05)，差异有统计学意义。

模型对照组及中药煎剂低、中剂量组全血黏度低切显著高于正常对照组(P<0.05)；正常对照组及各给药组显著低于模型对照组(P<0.05)；正常对照组，中药煎剂中、高剂量组，二甲双胍组显著低于中药煎剂低剂量组(P<0.05)，模型对照组显著高于中药煎剂低剂量组(P<0.05)；正常对照组，中药煎剂低剂量组，二甲双胍组显著低于中药煎剂中剂量组(P<0.05)，模型对照组、中药煎剂低剂量组显著高于中药煎剂中剂量组(P<0.05)；模型对照组、中药煎剂低、中剂量组显著高于中药煎剂高剂量组(P<0.05)，差异均具有统计学意义。

模型对照组及各给药组全血黏度中切显著高于正常对照组(P<0.05)；正常对照组及各给药组显著低于模型对照组(P<0.05)；正常对照组，中药煎剂中、高剂量组，二甲双胍组显著低于中药煎剂低剂量组(P<0.05)，模型对照组显著高于中药煎剂低剂量组(P<0.05)；正常对照组，中药煎剂低剂量组，二甲双胍组显著低于中药煎剂中剂量组(P<0.05)，模型对照组、中药煎剂低剂量组显著高于中药煎剂中剂量组(P<0.05)；模型对照组、中药煎剂低、中剂量组显著高于中药煎剂高剂量组(P<0.05)，正常对照组显著低于中药煎剂高剂量组(P<0.05)，差异均具有统计学意义。

模型对照组及中药煎剂各剂量组全血黏度高切显著高于正常对照组(P<0.05)；正常对照组及各给药组显著低于模型对照组(P<0.05)；正常对照组，中药煎剂高剂量组，二甲双胍组显著低于中药煎剂低剂量组(P<0.05)，模型对照组显著高于中药煎剂低剂量组(P<0.05)；正常对照组，中药煎剂高剂量组，二甲双胍组显著低于中药煎剂中剂量组(P<0.05)，模型对照组、中药煎剂低剂量组显著高于中药煎剂中剂量组(P<0.05)；模型对照组、中药煎剂低、中剂量组显著高于中药煎剂高剂量组(P<0.05)，正常对照组显著低于中药煎剂高剂量组(P<0.05)，差异均具有统计学意义。

模型对照组及中药煎剂低、中剂量组红细胞聚集数显著高于正常对照组(P<0.05)；正常对照组及各给药组显著低于模型对照组(P<0.05)；正常对照组，中药煎剂高剂量组，二甲双胍组显著低于中药煎剂低剂量组(P<0.05)，模型对照组显著高于中药煎剂低剂量组(P<0.05)；正常对照组显著低于中药煎剂中剂量组(P<0.05)，模型对照组显著高于中药煎剂中剂量组(P<0.05)；模型对照组、中药煎剂低剂量组显著高于中药煎剂高剂量组(P<0.05)，正常对照组显著低于中药煎剂高剂量组(P<0.05)，差异均具有统计学意义。见表5。

表5 对各组大鼠血液流变学的影响

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与中药煎剂低剂量组比较，cP<0.05；与中药煎剂中剂量组比较，dP<0.05；与中药煎剂高剂量组比较，eP<0.05

2.5 对2型DF部溃疡大鼠血清 VEGF水平的影响

模型对照组及中药煎剂低、中剂量组，二甲双胍组大鼠血清VEGF 水平显著高于正常对照组(P<0.05)；正常对照组及各给药组显著高于模型对照组(P<0.05)；正常对照组，中药煎剂中、高剂量组，二甲双胍组显著高于中药煎剂低剂量组(P<0.05)，模型对照组显著低于中药煎剂低剂量组(P<0.05)；正常对照组、中药煎剂高剂量组显著高于中药煎剂中剂量组(P<0.05)，模型对照组、中药煎剂低剂量组显著低于中药煎剂中剂量组(P<0.05)；模型对照组，中药煎剂低、中剂量组及二甲双胍组显著低于中药煎剂高剂量组(P<0.05)，差异均具有统计学意义。见表6。

表6 对各组大鼠血清 VEGF水平的影响

注：与正常对照组比较，aP<0.05；与模型对照组比较，bP<0.05；与中药煎剂低剂量组比较，cP<0.05；与中药煎剂中剂量组比较，dP<0.05；与中药煎剂高剂量组比较，eP<0.05

3 讨论

中医学认为，DF溃疡即糖尿病性肢端坏疽或糖尿病性动脉闭塞症，临床多表现为肢端疼痛、感染、溃疡、坏疽等，具体创面呈现“热、毒、瘀、腐”等为主要症状，属中医“消渴”“痈疽”“脱疽”范畴，以消渴日久损阴耗气而致气阴两虚、瘀血阻滞，日久化热，加以湿热下注、阳虚毒蕴导致气血凝滞、经络阻塞、肢端失养、肌肤溃烂为主要病机。多以凉血止痛、清热解毒、益气养阴、活血化瘀、化腐生肌为主来治疗[6]。目前，中药外用药成为治疗DF的有效方法，包括中药熏洗、塌渍、外敷等，可有效控制血糖、血脂、抗感染、抗凝、改善微循环等[7-11]。

本实验采用自拟中药煎剂，以足浴方式治疗DF溃疡。方中黄芪为君药,具有补气升阳、益气固表、托毒生肌之功[12]；四季青外敷使用具有良好的清热解毒、生肌敛创、活血止血的作用[10]。赤芍、三七等可活血祛瘀，消肿生肌，散瘀止痛，改善局部血液循环，也可促进肉芽组织生长、溃疡愈合[13-14]。此外，蜈蚣、血竭、土鳖虫攻毒散结、活血化癖、通络止痛、敛疮生肌，主治疮疡久溃不愈之证[15]。本实验结果显示，各给药组及模型对照组大鼠给药前DF评分均显著高于正常对照组，提示本实验制备DF溃疡大鼠模型成功。药后1、2周，中药煎剂中、高剂量组，二甲双胍组糖足评分均显著低于同期模型对照组(P<0.05)；中药煎剂低剂量与模型对照组比较，无显著性差异(P>0.05)；中药煎剂中、高剂量组，二甲双胍组间比较无显著性差异(P>0.05)。治疗2周后，中药煎剂中、高剂量组治疗效果较好，低剂量组治疗效果不明显。给药3周后，中药煎剂各剂量组、二甲双胍组大鼠下肢溃疡症状评分均显著低于同期模型对照组(P<0.05)；中药煎剂中、高剂量组，二甲双胍组均显著低于中药煎剂低剂量组(P<0.05)，差异有统计学意义，中药煎剂中、高剂量组，二甲双胍组间比较无显著性差异(P>0.05)。治疗3周后，中药煎剂各剂量组治疗效果均较好。提示自拟中药煎剂随时间的延长，足浴方式治疗DF溃疡疗效逐渐显著，且有剂量依赖关系。

现代医学认为，DF溃疡易出现代谢紊乱，血液循环障碍，高血糖、高血脂，血小板聚集，血液高凝，下肢血管硬化，管壁增厚，弹性下降，导致血栓形成增多，动脉内膜损伤，粥样硬化的程度加大，最终导致下肢堵塞，缺血、缺氧，最终出现支端溃疡或坏疽[8,16]。慢性血管病变在糖尿病坏疽的发生发展中有重要作用，VEGF与血管内皮功能息息相关[17-18]。本研究结果显示，给药后3周，各给药组大鼠全血黏度高、中、低切及红细胞聚集数均显著低于模型对照组(P<0.01)；血清VEGF水平均显著高于模型对照组(P<0.01)，差异有统计学意义；给药组组间比较均具有显著性差异(P<0.05)，其中，中药煎剂高剂量组最具差异性。提示自拟中药煎剂可有效降低血糖，改善“三多一少”症状，减轻血小板聚集，血液高凝状态，对血栓形成导致的下肢缺血、缺氧症状有很好的治疗作用，且存在剂量依赖性关系。

综上所述，自拟中药煎剂可有效治疗DF部溃疡，改善血液循环以及神经病变，改善代谢紊乱，抗感染，促进肉芽组织及上皮细胞的形成，具有传统中药的安全有效、不良反应小等特点，值得进一步推广，但具体治疗机制还需进一步探讨。