生地注射液对脑出血大鼠神经功能修复及抗凋亡作用的研究*

张宗奇，俞晓飞

(上海中医药大学附属曙光医院神经内科，上海 200021)

生地注射液对脑出血大鼠神经功能修复及抗凋亡作用的研究
*

张宗奇，俞晓飞△

(上海中医药大学附属曙光医院神经内科，上海 200021)

目的:探讨生地注射液对实验性脑出血大鼠神经功能修复及抗凋亡作用。方法:采用Ⅶ型胶原酶加肝素，脑内尾状核注射法，建立SD大鼠脑出血模型。将70只大鼠按体质量分为空白对照组、假手术组、模型对照组、生地注射液组和清开灵注射液组。从神经功能缺损评分、脑组织病理形态学、细胞凋亡等方面进行用药前后及组间比较研究。结果:生地注射液组大鼠脑组织病理形态学观察结果与清开灵注射液组相似，较模型组明显改善;神经功能评分明显改善，细胞凋亡数目明显减少，与模型组比较差异有统计学意义，与清开灵注射液组之间比较差异无统计学意义。提示生地注射液对实验性脑出血大鼠有一定疗效，可促进神经功能修复，减少神经细胞凋亡数目。结论:生地注射液对脑出血大鼠具有神经修复及抗神经细胞凋亡作用。

生地注射液;脑出血;神经功能;凋亡

急性脑出血严重威胁人类生命健康，出血性中风证属本虚标实，其发生、发展、演变过程反映了患者真阴亏虚的演变过程。在长期的临床实践基础上，上海市名中医王左教授提出以养阴法为指导思想，运用生地注射液治疗急性出血性中风。生地注射液由单味中药生地制成，生地味甘、苦，微寒，具有养阴生津、清热凉血止血之功效。前期随机对照临床试验［1］结果显示，生地注射液(40ml/d，每日1次，静滴14d)治疗出血性中风具有确切疗效。本研究通过脑出血大鼠模型，进一步探讨生地注射液治疗急性脑出血在神经功能修复及抗凋亡方面的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 SD雄性清洁级大鼠70只，体质量(250±25)g，由上海中医药大学动物中心提供(动物合格证号SCXK(沪)2003-0002)。动物饲养在室温(22±2)℃、湿度45%～65%和明暗交替(12 h∶12h)环境中，自由摄食和饮水。

1.1.2 药品与试剂 生地注射液10ml/支，由上海中医药大学附属曙光医院制剂室提供(批号020122);清开灵注射液10ml/支，北京中医药大学药厂(国药准字Z11020269);生理盐水500ml，上海华源常富药业有限公司(国药准字H31021918);Ⅶ型胶原酶 3KU(SIGMA-ALDRICH．Inc．);肝素钠12500u(上海第一生化药业有限公司060601);甲醛(上海溶剂厂，批号2006.11.2010);多聚甲醛(中国医药集团上海化学试剂公司);二甲苯(批号Lot，No．F2006.11.20);无水乙醇(批号20070105);95%乙醇(批号Lot，No．KJ20060718);APO-Brdu-IHCTM试剂盒(Biovision．Inc．);甲醇(国药集团化学试剂有限公司，批号Lot，NoF20061101);三羟甲基氨基甲烷(上海化学试剂分装厂，批号901113);30% H2O2(国药集团化学试剂有限公司，批号 Lot，NoYD20060801);中性树胶(国药集团，批号 Lot，NoBB20060809)。

1.1.3 仪器 江湾Ⅱ型动物头颅立体定位仪(上海第二军医大学器材处生产);台式牙科钻307-6 (上海齿科器械厂生产);5μl微量注射器(上海高欣玻璃仪器厂生产);切片机(LEICARM2135);自动脱水机(LEICATP1020C4);包埋机(LEICAEG1160);电热恒温鼓风干燥机(DHG-9240A型，上海科技有限公司);电热恒温水温箱(上海跃进医疗器械厂);旋涡混合器XW-80A(上海医大仪器厂);MIAS病理图像分析系统(motic公司，厦门);显微镜(Olympus BX51);摄像头(moticam1300)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 大鼠在正常环境下适应性饲养1周后称重编号后分为空白对照组、假手术组、模型对照组、生地注射液组和清开灵注射液组5组各14只，分笼饲养，每笼6～8只。

1.2.2 大鼠脑出血模型的建立 1μl含Ⅶ型胶原酶0.5u加肝素钠6.25u溶液，于室温下冰浴配制并分装，放于－20℃冰箱内保存。使用前在室温下冰浴中缓慢溶解后，在振荡器上轻微摇匀，重新置于冰浴中以备使用。生理盐水代替Ⅶ型胶原酶肝素钠，用于假手术组的造模用药。麻醉剂3%戊巴比妥按50mg/kg体质量腹腔注射麻醉。消毒剂75%酒精、碘酊用于剪毛术后的消毒。大鼠脑出血模型的造模用药和定位参考文献报道［2-3］。大鼠术前禁食12h禁水4h，用3%戊巴比妥进行腹腔注射麻醉，保证手术操作期间大鼠有自主呼吸，俯卧固定于江湾Ⅱ型动物头颅立体定位仪上，依次剪毛、消毒，头皮正中矢状切开0.8cm剥离骨膜，取前囟为原点，向右3mm、向后1mm，深度5mm为注射点(尾状核)，以牙科钻钻开颅骨，进针达5mm后缓慢注射药物溶液9min，缓慢退针，骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合皮肤。术后大鼠被送至动物房饲养。假手术组用1μl生理盐水代替Ⅶ型胶原酶肝素钠注射，其余各组(不包括空白对照组)均以1μl含Ⅶ型胶原酶0.5u、肝素钠6.25u溶液注射造模。以Longa［4］神经症状5级评分法进行判定，1～3分为造模成功，造模成功率为85%。

1.2.3 动物用药和途径 假手术组术后2h腹腔注射生理盐水4ml/kg，每日2次，连续3d;模型对照组造模后2h腹腔注射生理盐水4ml/kg，每日2次，连续3d;清开灵注射液组造模后2h腹腔注射清开灵注射液4ml/kg，每日2次，连续3d(相当于人临床等效剂量);生地注射液组造模后2h腹腔注射生地注射液4ml/kg，每日2次，连续3d(相当于人临床等效剂量);空白对照组常规喂养。

1.3 检测方法

1.3.1 神经功能缺损评分标准 参照Longa5级评分法，造模各组分别于造模后3、6、12、24、48、72h进行神经功能缺损评分:0级:没有神经功能缺损，记0分;Ⅰ级:动物不能完全伸直其前肢，记1分;Ⅱ级:动物一侧肢体瘫痪并有追尾现象，记2分;Ⅲ级:动物不能站立/打滚，记3分;Ⅳ级:无自发性活动，有意识障碍，记4分。

1.3.2 脑组织标本制备 实验动物在第3天最后1次用药3h后，取每组大鼠各6只称重，以3%戊巴比妥腹腔麻醉，仰卧固定于手术板上。开胸、暴露心脏，经左心室升主动脉插管，并以血管夹固定，同时以眼科剪于右心耳剪开一小口，先灌注0.9%生理盐水250ml冲洗，直至流出液变清，再灌注4%多聚甲醛磷酸缓冲液250ml(4℃，为加入0.01mol/LPBS，pH7.4，4%的多聚甲醛)，速度先快后慢，灌注时间约30min，动物肢体变硬，肝脏变白变硬。断头取脑，在培养皿内去除小脑和脑干，沿大脑半球矢状线切开取右侧造模半脑，以带有标记纸的大头针刺入用以标记，然后放入10%甲醛溶液中固定备用。

1.3.3 脑组织石蜡包埋和切片 取出固定于10%甲醛中的脑组织用自来水冲洗10h，并依次用70%(3h)、80%(3h)、95%(2h)、100%(2h)乙醇梯度脱水。在二甲苯中浸泡1h使组织透明，52℃石蜡溶液中浸泡2h，以石蜡包埋脑组织。将脑组织横断面切成5μm厚的切片，敷贴于涂胶载玻片上，在60℃下烤片4h后放置备用。所有载玻片均有标记。

1.3.4 脑组织切片HE染色 随机抽取各组3只大鼠脑组织切片行HE染色，做一般病理学观察。①将切片置于二甲苯ⅠⅡ脱腊10min;②于100%乙醇ⅠⅡ(5s)、95%乙醇ⅠⅡ(5s)乙醇梯度浸泡;③清水漂洗5min3次沥干;④苏木素染色5min;⑤清水漂洗5min3次至水色变清沥干;⑥1%盐酸乙醇分化5s，再以清水漂洗同⑤;⑦温水返蓝30min，重复步骤⑤;⑧伊红复染，伊红A液2min，伊红B液2min;⑨于95%乙醇ⅠⅡ浸泡5s，100%乙醇ⅠⅡ浸泡5s;⑩二甲苯ⅠⅡ ⅢⅣ浸5s;瑏瑡中性树胶封片;瑏瑢光学显微镜下观察并摄片。

1.3.5 脑组织细胞凋亡的测定 通过免疫组织化学方法双色TUNEL分析标记DNA断裂以检测细胞凋亡。①石蜡包埋脑组织染色:每次随机抽取脑组织载玻片10片进行染色。试剂使用前按试剂说明书解冻、离心，严格储存温度，根据每次所需试剂量按说明书配制;②细胞凋亡图像分析:随机抽取每组细胞凋亡检测载玻片各3片，每片在光学显微镜下200x观察，于不相邻视野摄取照片2张;以图像分析仪分析定标200x，点出细胞凋亡棕色阳性颗粒，进行单点彩色分割，并去杂孤立点，继以体视分析，以数密度为计算统计单位，数密度=目标个数/统计场面积μm2。

1.4 统计学方法

采用SPSS18．0统计软件进行方差分析和显著性检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 神经功能缺损积分动态变化比较

表1显示，假手术组大鼠未见有神经功能缺损，模型组、生地注射液组、清开灵注射液组大鼠造模后3h神经功能评分比较差异无统计学意义(P＞0.05)，72h后模型组与生地注射液组及清开灵组分别比较差异有统计学意义(P＜0.05)，生地注射液组及清开灵组的神经功能积分明显降低，而生地注射液组与清开灵组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，提示生地注射液能促进脑出血模型大鼠神经功能的修复。

表1 模型组、生地组、清开灵组3、72h神经功能评分比较(±s)

表1 模型组、生地组、清开灵组3、72h神经功能评分比较(±s)

注:3h各组比较: P＞0.05;72h生地组与清开灵组比较:△P＞0.05;72h模型组与其他组比较:#P＜0.05

组别 鼠数 3h神经功能评分 72h 神经功能评分模 型 对 照 组 8 2.00±0.53 1.00±0.00﹟生地注射液组 8 2.00±0.76 0.50±0.53△清开灵注射液组8 2.38±0.52 0.38±0.52

图1显示，以上各组大鼠神经功能积分均于12 h后明显改善，而清开灵注射液组和生地注射液组积分下降幅度明显加快，72h后与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 各组大鼠脑组织一般病理形态学光学显微镜下观察结果

图2显示，空白对照组大脑及尾状核、基底节区组织结构正常，神经元及神经纤维均完好，血管未见扩张充血，血管周围间隙无明显增宽，未见炎性细胞浸润。假手术组镜下观察结果与空白对照组基本相似。模型对照组病变主要位于尾状核、基底节区域，脑组织中出现范围较大的出血，有些呈多发灶性出血，出血区神经元变性及液化性坏死而消失，间质血管显著扩张充血，管周间隙因水肿而增宽。生地注射液组病变区脑组织中出血范围缩小，损伤的神经元数量较模型对照组明显减少，间质血管扩张程度及管周水肿程度均为减轻。清开灵注射液组镜下观察结果与生地注射液组大致相近。

图1 脑出血模型大鼠神经功能积分时点变化比较

2.3 各组大鼠脑细胞凋亡计数比较

图3显示，各组大鼠3d后脑细胞凋亡检测结果显示，模型组细胞凋亡数明显增高，与其他各组比较差异有统计学意义(P＜0.01);生地注射液组与清开灵注射液组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但生地注射液组细胞凋亡数仍高于假手术组，差异有统计学意义(P＜0.01)，清开灵注射液组细胞凋亡数虽然高于假手术组，但比较结果差异无统计学意义(P＞0.05)，提示生地注射液具有一定的抗细胞凋亡作用。

表3 各组大鼠3d后脑细胞凋亡计数比较(±s，×10－9)

表3 各组大鼠3d后脑细胞凋亡计数比较(±s，×10－9)

注:与假手术组比较:△P＜0.05，与其他各组比较:P＜0.01;与各组比较:▲P＜0.01;与清开灵注射液组比较:▲P＞0.05，与假手术组比较:P＜0.01，△P＞0.05

组别 鼠数 数密度(个/μm2)空 白 对 照 组 3 1.37±0.69△假 手 术 组 3 2.53±0.58生 地 注 射 液 组 3 3.90±0.78△清开灵注射液组 3 3.37±0.41△模 型 对 照 组 3 10.13±1.23▲

3 讨论

图2 各组大鼠脑组织病理形态学光学观察结果比较

王左认为［5］出血性中风的根本为肾阴不足，阴虚火旺，变生它邪。肾阴不足乃患病之根本，并影响着病情的发展与转归。肝肾阴亏、水不涵木则肝阳上亢，阳升风动，气机升降失调，变生它邪，阻滞经脉而致卒中;而实邪壅盛，痹阻经络，败坏脏腑，进一步损伤真阴，使病情恶化。因此，阴虚在卒中的发生、发展、演变中起至关重要的作用。遂强调出血性中风急性期治疗即应加强固护肾阴，提出以养阴法为治疗指导思想，用生地注射液治疗急性出血性中风。生地味甘、苦、微寒，归心、肝、肾经，具有养阴生津、清热凉血止血之功效，用于治疗急性脑出血，可养阴生津、清热凉血止血，使阴复而风火自除，痰瘀易散，气血运行正常。前期研究［1］证明了生地注射液临床治疗急性脑出血的有效性。本实验进一步通过脑出血大鼠模型探讨生地注射液治疗脑出血的可能作用机制。实验结果表明，与模型组比较，生地注射液组大鼠神经功能评分明显改善，脑组织病理形态学改善，细胞凋亡数目明显减少，提示生地注射液对实验性脑出血大鼠有保护作用，可促进神经功能修复，减少神经细胞凋亡数目。

图3 各组大鼠3d后脑细胞凋亡计数比较

脑出血后导致神经细胞死亡的机制复杂，凋亡机制是参与脑出血后神经细胞死亡的重要过程。抗凋亡可能是脑出血的治疗途径之一。研究表明，脑出血后血液凝固所释放的凝血酶、其他血肿成分及其降解产物产生的毒性作用，以及血肿周围形成的炎症级联反应是导致细胞凋亡的主要原因。目前细胞凋亡的启动因素尚不明了，且引起的机制和因素多而繁杂，因而抗凋亡治疗应从多层面着手。现代药理学研究证实，生地具有止血作用［6］，其止血功能可能是生地注射液发挥治疗作用的机制之一;梓醇是生地的主要活性成分之一，研究［7］证明，梓醇对缺血再灌注神经元有保护作用，使凋亡细胞数明显降低;地黄煎剂可明显抑制Ca2+、Mg2+-ATP酶活性升高，提示地黄中可能含有钙拮抗活性物质［8］。霍泳宁［9］等研究证实，生地的醚提取物对提高大鼠血浆中SOD活性有显著作用，生地水提取物对提高大鼠血浆中谷胱甘肽过氧化酶(GST-px)活性有显著作用，生地的醇提取物对减少大鼠血浆中的丙二醛(MDA)含量有明显作用，提示生地的养阴生津作用与其具有激发内源性抗氧化酶活性和抗体内脂质超氧化有关。樊淼［10］等研究证实，生地主要成分对大鼠脑片氧化应激损伤具有保护作用。许红［11］等研究证实，生地黄可通过抑制血管内皮细胞血浆内皮素(ET)的释放而发挥抗瘀血作用。刘爱华等［12］实验研究证实，生地注射液对凝血酶损伤神经具有保护作用。急性脑出血时存在应激、免疫与炎症反应、自由基损伤、钙超载、脑细胞的损伤与凋亡等复杂病理过程，地黄的有效成分具有多系统、多靶点的药理作用，其抗凝血酶损伤、钙拮抗、抗自由基及氧化应激等作用，可能是其抗凋亡作用的部分机制，为生地注射液治疗出血性中风的临床应用提供了科学依据，其促进脑出血模型大鼠神经功能修复及抗凋亡作用的具体机制可能是多方面的，值得进一步深入研究。

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StudyofShengdiInjectionontheNerveFunctionandAntiApoptosisof theRatswithIntracerebralHemorrhage

ZHANGZong-qi，YUXiao-fei△
(DepartmentofNeurology，ShuguangHospitalAffiliatedtoShanghaiUniversityofTraditional ChineseMedicine，Shanghai201203，China)

Objective:TodiscusstheeffectsofShengdiinjectiononneurologicalfunctionrepairandanti-apoptosisin ratsofcerebralhemorrhage．Methods:TheratmodelofcerebralhemorrhagewasestablishedbyinjectingⅦ collagenaseheparinintocaudatenucleusofbrain．70ratswererandomlydividedintofivegroups:normalgroup，shamgroup，model group，ShengdigroupandQingkailinggroup．Thefollowingtests，includingthescoreforneurologicalimpairment，pathomorphologyofbraintissue，apoptosiswereanalyzedamonggroups．Results:Thesimilarresultsofpathomorphology，thescoreforneurologicalfunctionimpairmentandthenumberofapoptosis，wereobservedbetweenShengdigroupand Qingkailinggroup．Moreover，pathomorphologyofbraintissueandthescoreforneurologicalfunctionimpairmentwere improvedsignificantlyinShengdigroupcomparedwithmodelgroup．ThenumberofapoptosisreducedinShengdigroup comparedwithmodelgroup．Conclusion:Shengdiinjectioncanprotectneuronalandresistapoptosisinratswithcerebral hemorrhage．

ShengdiInjection;CerebralHemorrhage;NeurologicalFunction;Apoptotosis

R285.5

:B

:1006-3250(2015)08-0939-04

2015-02-17

上海市教育委员会科研项目(05cz19);上海中医药大学后备业务专家培养项目(EX-2011-上中大-医-004)

张宗奇(1964-)，河南洛阳人，副主任医师，医学博士，从事中医治疗中风病的临床与研究。

△通讯作者:俞晓飞(1977-)，江西婺源人，副主任医师，医学博士，硕士研究生导师，从事中西医结合脑病的临床与研究，Tel:13331978806，E-mail:doctorxiaoyu@sina．com。