左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨及成脂诱导的研究*

徐 岩，宋 囡，任艳玲△

(1．辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600;2．辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110847)

左、右归丸对大鼠骨髓间充质干细胞成骨及成脂诱导的研究
*

徐 岩1，宋 囡2，任艳玲2△

(1．辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600;2．辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110847)

目的:研究体外左、右归丸诱导大鼠骨髓充质干细胞(bonemarrowstromalstemcells，BMSCs)成骨及成脂的影响。方法:以左、右归丸水煎液和阳性对照药补佳乐、蒸馏水分别给予SD大鼠灌胃取血制备含药血清，分别加成骨和成脂诱导剂干预BMSCs，成骨诱导后采用改良钙钴法检测碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)表达，成脂诱导第10天油红O染色。结果:左、右归丸组与空白组比较，可显著提高细胞中ALP活性，促进钙化结节形成;左、右归丸可减少脂滴形成，降低细胞中甘油三酯含量。结论:左、右归丸对BMSCs分化的调节具有双向性，既促进BMSCs成骨分化同时又抑制BMSCs成脂分化。

左归丸;右归丸;骨髓间充质干细胞;成脂;成骨

骨髓充质干细胞(bonemarrowstromalstem cells，BMSCs)是一种成体多能干细胞，可在不同生物环境和细胞因子作用下分化为成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等［1］。作为具有多向分化潜能及自我更新能力的干细胞，它能够通过分化成为成骨细胞促进骨生成［2］。随着年龄增长及骨髓内微环境变化，BMSCs更趋向成脂分化形成脂肪细胞，同时使成骨能力减弱，导致骨质疏松症。目前对髓腔中最丰富的脂肪细胞研究较少，尤其是对中医补肾益精的经典代表方左、右归丸在成脂诱导方面的研究较为罕见。根据“肾藏精，精生髓，髓养骨”理论，我们侧重同时研究左、右归丸对成骨和成脂诱导这两方面的作用，实验中对体外细胞分别加成骨及成脂诱导剂观察二者的结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD雌性大鼠20只，体质量(210±10)g，按随机数字表法分为4组各5只，以制备含药血清，采用同种2月龄雄性大鼠1只提取和培养骨髓间充质干细胞，大鼠均由辽宁长生生物技术有限公司提供(许可证号SCXK(辽) 2010-0001)。

1.1.2 药物及试剂 本实验中药饮片均在辽宁中医药大学附属第一医院购买。左归丸组成:熟地黄24g，炒山药12g，枸杞子12g，山茱萸12g，鹿角胶12g，菟丝子12g，牛膝9g，龟板胶12g，右归丸:熟地黄24g，炒山药12g，枸杞子12g，山茱萸12g，鹿角胶12g，菟丝子12g，当归9g，肉桂6g，杜仲9g，附子6g。将2种药制备为水煎剂，生药量为1 g·mL－1;补佳乐戊酸雌二醇片(法国 DELPHARM LilleS．A．S．批号国药准字J20080036);改良型α-MEM培养液、胎牛血清FBS(Hyclone);胰酶、油红O、地塞米松、3-异丁基-1甲基黄嘌呤IBMX、吲哚美辛(Sigma);胰岛素(Biotopped)。

1.1.3 仪器 3111二氧化碳培养箱(Thermo，美国);DFC320型倒置显微镜(Leica，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 含药血清制备与实验分组 表1显示，20只大鼠按随机数字表法分为左归丸组(ZGW)、右归丸组(YGW)、补佳乐组(BJL)、空白对照组(Control)4组各5只。以每kg体质量大鼠的给药量为正常人给药量6.3倍，每次大鼠给药量以正常人给药量的2倍计算，计算后为左归丸组18.9g· kg－1体质量，右归丸组20.52g·kg－1体质量，西药组0.18mg·kg－1体质量，空白对照组1.0g·kg－1体质量，每日灌服2次，相当于药物生药量的1g·mL－1，空白对照组灌服蒸馏水。第4天早晨给药2h后麻醉，腹主动脉取血后静置2h，离心(2500rpm，4℃，20min)后收集血清，56℃水浴灭活30min后分装，－86℃保存。实验分为成骨和成脂诱导两部分，分别为4组。其中成骨诱导剂含10－7mol·L－1地塞米松、10mmol·L－1β-甘油磷酸钠和50μmol·L－1维生素C的α-MEM培养液，成脂诱导剂含1μmol·L－1地塞米松、10μg·ml－1胰岛素、100μmol·L－1吲哚美辛和500μmol·L－13-异丁基-1甲基黄嘌呤(IBMX)的α-MEM培养液。

表1 各实验分组

1.2.2 BMSCs的分离培养 颈椎脱臼法将2月龄左右SD大鼠处死，浸泡在75%乙醇中15min后移入超净台，迅速取出双侧股骨及胫骨并剪去骨两端，用含青、链霉素的α-MEM培养液5mL反复冲洗骨髓腔，直至骨颜色变白，培养液移入离心管中，离心(1000rpm/3min)并弃去上清液，用含10% FBS的α-MEM培养液反复吹打，使细胞重悬放入培养瓶中，培养箱培养至P4代时即可用于实验。

1.2.3 改良钙钴法检测ALP表达 3%β-甘油磷酸钠、2%巴比妥钠、2%无水氯化钙、2%硫酸镁和蒸馏水5ml配制ALP染色孵育液(pH9.4)。细胞以每孔500μL接种于24孔培养板中，药物干预14d后弃原培养液，95%乙醇固定15min后干燥，加新配孵育液，培养箱中孵育4h后流水洗10min，在2%硝酸钴中作用5min后去离子水洗片刻，用现配1%硫化铵溶液处理1min，再用水冲洗、晾干，倒置显微镜观察并拍照。

1.2.4 油红O染色及定量 将BMSCs接种于24孔板(每孔200μL)，于1d后加含10%各组含药血清的成脂诱导液，第4天换含10%各组含药血清的成脂维持液，继续培养7d后去孔板内培养液，PBS清洗3次，多聚甲醛固定20min后PBS润洗3次、吸干，0.5%油红O染色1h，蒸馏水洗3次，倒置显微镜下观察并拍照。

1.2.5 统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计分析，采用 LSD或Tamhane's方法，数据以均数±标准差(±s)表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs形态学观察

细胞接种于培养瓶24h后可见少量透亮细胞贴壁，以圆形居多。4d后可见大部分细胞形成突触，在细胞呈多角形或菱形时第1次换液，约10d后细胞融合率达80%左右时首次传代，细胞传到P4代多呈纺锤形生长，排列多成旋涡状(图1)。

图1 BMSCs细胞形态(×200)

2.2 改良钙钴法染色及结果

采用成骨诱导液诱导大鼠BMSCs细胞后，细胞合成的ALP经过改良钙钴法染色，阳性表现为细胞内含有棕黑色细微颗粒。实验各组染色均有差异。与Control+GYDJ组比较，ZGW+GYDJ组、YGW+ GYDJ组、BJL+GYDJ组棕黑色颗粒明显较多，细胞突触多而长且密度增大，均能显著增强BMSCsALP活性(P＜0.05)。与ZGW+GYDJ组比较，BJL+ GYDJ组、YGW+GYDJ组的BMSCsALP活性诱导明显减弱(P＜0.05)，且YGW+GYDJ组优于BJL+ GYDJ组(P＜0.05)。

2.3 油红O染色结果

采用成脂诱导后，部分细胞体积增大，梭形变圆形，胞内出现空泡样结构并含大小不等高亮度串珠状脂肪滴，随诱导时间延长，含脂滴细胞数增多，脂滴体积增大，占细胞体的50%左右。油红O染色阳性表现为细胞内脂滴被染成亮红色，诱导第10天各组油红染色均有差异，与Control+ZYDJ组比较，ZGW+ZYDJ组、YGW+ZYDJ组、BJL+ZYDJ组亮红色含脂滴细胞均减少，脂滴体积变小，均显著抑制BMSCs脂肪滴的形成(P＜0.05)。与BJL+ZYDJ组比较，ZGW+ZYDJ组、YGW+ZYDJ组亮红色脂滴细胞数量减少更明显，脂滴体积较小，均显著抑制BMSCs脂肪滴的形成(P＜0.05)。而ZGW+ZYDJ组与YGW+ZYDJ组之间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

图2 左、右归丸含药血清对BMSCs成骨的影响(×200) A．Control+GYDJ组;B．BJL+GYDJ; C．YGW+GYDJ组;D．ZGW+GYDJ组

图3 左、右归丸含药血清对BMSCsALP活性的影响(×200) A．Control+ZYDJ组;B．BJL+ZYDJ组; C．YGW+ZYDJ组;D．ZGW+ZYDJ组

3 讨论

中医认为“肾生骨髓”、“肾充则髓实”(《素问·阴阳应象大论》)。骨髓藏于髓腔内，而BMSCs也存在于骨髓中，与“肾主骨”理论有相似之处。左、右归丸出自《景岳全书·新方八阵》，是中医补肾益精经典代表方，左归丸重在滋阴补肾、填精益髓，右归丸重在温补肾阳、填精益髓。已有研究证实，左、右归丸可促进BMSCs的成骨诱导并可通过TGF-β1/ Smad4信号表达途径影响BMSCs成骨［3-5］。但长期以来，人们多重视BMSCs成骨诱导方面的研究，疏于对成脂诱导的研究。有研究表明，髓腔中脂肪细胞只是填充无造血功能的骨髓空间，后研究发现脂肪细胞的增加伴随着成骨细胞的减少［6］，两者具有此消彼长的关系，提示成骨细胞与脂肪细胞分化可能具有共同的作用调控点［7-8］。国外学者提出，通过抑制骨髓基质干细胞脂肪分化来防治骨质疏松症的新观点［9］。国内也有有学者提出“脂肪细胞过剩”假说，认为脂肪细胞的刺激能造成成骨细胞-破骨细胞偶联失衡抑制细胞ALP活性及成骨细胞增殖［7］。也有研究显示，部分补肾方药均不同程度地促进成骨分化，抑制成脂分化［［10-12］。故在本次实验中我们侧重左、右归丸对BMSCs成骨及成脂诱导方面的研究。

本实验结果左、右归丸对BMSCs分化调节有双向性，即它们在促进BMSCs成骨分化的同时又可抑制BMSCs成脂分化，但两者差异性还不够明确，同时两方诱导BMSCs成骨、成脂分化的进一步机制也有待深入探究。

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StudyofZuoguiPillandYouguiPillonOsteogenesisandFatInducedin theRatBoneMarrowMesenchymalStemCell

XUYan1，SONGNan2，RENYan-Ling2△
(1．MedicineCollege，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Dalian116600，China;2．CollegeofBasic Medicine，MedicalCollege，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110847，China)

Objective:ToinvestigatetheeffectofZuoGuiWanandYouGuiWaninducedonosteogenesisandadipogenic ofratsbonemarrowstromalstemcells(BMSCs)．Method:PreparethemedicatedserumcontainingZuoGuiWan、YouGuiWan、positivecontroldrug(EstradiolValerate)tosimultaneouslyintervenetheBMSCs．TheALPtestwasmeasured bymodifiedcalicium-combatstainingmethodafterosteogenicinduction．After10daysofadipogenicinduction，oilredO stainingoflipiddropswasusedtodetecttheadipogenicabilityofBMSCs．Results:Zuoguiwan，YouGuiWan，significantly enhancedtheALPactivityoftheBMSCsandthenumberofcalcifiednodules．Zuoguiwan，YouGuiWansignificantlyreduced theformationoftriglyceridelevels．Conclusion:Zuoguiwan，YouGuiWanhavebiphasicregulationofBMSCs，whichcan promoteBMSCsosteogenesisandrestrainBMSCsadipogenicatthesametime．

ZuoGuiWan;YouGuiWan;bonemarrowstromalstemcells;adipogenic;osteogenesis

R285．5

:B

:1006-3250(2015)08-0946-03

2015-01-12

国家自然科学基金资助项目(81373527)

徐 岩，在读硕士，从事中药理论及应用研究。

△通讯作者:任艳玲，教授，医学博士，博士研究生导师，从事方药配伍规律及作用机制研究，Tel:024-31207267，E-mail: yanlingren@tom．com。