镉胁迫对匍匐剪股颖生长及生理生化的影响

邓一飞，徐佳敏，张文举，邓志瑞

（上海大学生命科学学院，上海200444）

匍匐剪股颖（Agrostis stolonifer a）原产于欧亚大陆，是最抗寒的冷季型草坪草之一。其草质柔软、细嫩、生长迅速、草坪优美、观赏性强，已被世界各国广泛用于建植高档观赏型草坪和运动型草坪，如城市中心广场、高尔夫球场的果岭草坪和保龄球场等［1］。这类草坪建植所需用地面积较大，往往选在开采过的矿区或受过污染的土地上，另外由于本身抗性不强及日益严重的重金属污染现状，所以其抗重金属胁迫能力还有待提高。

Cd因为迁移性强且极易被植物吸收并积累，已经成为对植物毒性最强的重金属元素之一，仅次于汞［2］。环境中Cd之所以过量主要是人为原因，从化肥和农药的滥用，到污水污泥的乱排乱放，这种现象多见于东欧，现在在印度等发展中国家这种现象越来越普遍［3－6］，近年来伴随着采矿、冶金以及Cd处理等工业的发展，我国农业土壤受Cd污染也日趋严重［7］，贵阳市郊区受污染的土壤Cd含量达5.6 mg·kg－1［8］。Cd、Pb已成为南方土壤污染中常见的重金属元素，一般土壤中的Cd、Pb含量已超过土壤正常值的3～4倍［9］。上海蚂蚁浜地区受重金属污染的土壤平均Cd含量21.4～130 mg·kg－1［10］。本研究分析重金属Cd对匍匐剪股颖种子萌发、幼苗和植株生长的影响，旨在探究匍匐剪股颖遭受Cd胁迫的生理生态响应，从而为利用转基因技术培育抗重金属Cd的新种质提供量化线索［11］。

1 材料与方法

1.1 试验材料

匍匐剪股颖Penn A－4 品种的成熟种子，由上海交通大学王兆龙教授惠赠［11］。

1.2 匍匐剪股颖幼苗培养与Cd处理

参照曾泉和徐子勤［12］、张远兵等［13］的方法处理接种种子。先用70%酒精处理5 min，蒸馏水清洗3次，然后用10%次氯酸钠灭菌20 min，蒸馏水清洗3次，再置于无菌蒸馏水中浸泡12 h后用消毒过的牙签将种子每皿100粒转移到铺有滤纸的培养皿中。用Cd Cl2·2.5 H2O 和蒸馏水配制Cd2＋浓度分别为0（CK）、50、100、200和400 mg·L－1处理液，各处理组培养皿分别加入上述氯化镉溶液，每皿10 mL，每处理设5个重复，于光照培养箱［（25±1）℃，光照为12 h］培养。第7天从光照培养箱中取出含有发芽种子培养皿，倒掉内部溶液，换用Cd2＋浓度分别与种子处理相同的1／2 Hoagland营养液，每皿5 mL，在同样条件下进行光照培养，以后每天更换处理液。

1.3 匍匐剪股颖种子萌发率、幼苗生长生理指标测定

种子接种于培养皿，第7天测发芽率，发芽率＝（第7天发芽种子数／接种总数）×100%；第15天测芽长、根长和苗鲜重，第30天测定各项生理指标，超氧化物歧化酶（SOD）活力采用NBT 法，以抑制光化还原的50%为一个SOD 酶活性单位［14］；过氧化物酶（POD）活力采用愈创木酚法，以每分钟内A470变化0.01为一个POD 活性单位［14］；叶绿素和丙二醛（MDA）的含量按照王学奎［15］的方法测定。

1.4 匍匐剪股颖植株培养与Cd处理

种子播于花盆，自然条件下生长，90 d后从土中移出长势一致的植株，洗净附着在根部的土，用固根器（定植篮）作支持物，用Cd2＋浓度为0、2、10、50和100 mg·L－1的1／2 Hoagland营养液进行溶液培养，每处理3个重复。处理后的0、5、10、15和20 d分别取植株的叶和根，测各项生理指标，方法同1.3。

1.5 数据分析

数据分析采用SPSS分析软件，Duncan多重比较法分析处理间方差，5%水平差异［11］。

2 结果与分析

2.1 Cd胁迫对匍匐剪股颖种子发芽的影响

匍匐剪股颖种子发芽率随着Cd2＋浓度的上升呈显著下降趋势（P＜0.05）（图1）。当Cd2＋浓度为50 mg·L－1时，下降幅度较大，发芽率＜50%，不到CK 的1／2，说明50 mg·L－1的Cd2＋已经对种子发芽具有较大的毒害作用。当Cd2＋浓度为100 mg·L－1时，发芽率为21%，仅为对照的1／4，400 mg·L－1的Cd2＋已经完全抑制了种子的发芽（未计入图），后续试验已不再包括400 mg·L－1处理。

图1 Cd胁迫对匍匐剪股颖种子发芽的影响Fig.1 Effects of Cd stress on creeping bentgrass seed ger mination

2.2 Cd胁迫对匍匐剪股颖幼苗的影响

2.2.1 Cd胁迫对匍匐剪股颖幼苗芽长、根长及苗鲜重的影响 Cd2＋对幼苗芽、根的生长都具有抑制作用（图2）。随着Cd2＋浓度的增加，幼苗芽长显著减小（P＜0.05）。当Cd2＋浓度为50 mg·L－1时，平均芽长为1.71 c m，比对照低13%；当Cd2＋浓度为100 mg·L－1时，平均芽长为1.54 c m，比对照低22%；当Cd2＋浓度为200 mg·L－1时，平均芽长为1.29 c m，只有对照的65%（图2）。当Cd2＋浓度为50 mg·L－1时，根长下降幅度较大，平均根长为0.89 c m，是对照的54%，之后的变化趋势较为平缓（图2），说明50 mg·L－1的Cd2＋已经对幼苗根长的生长产生了较大的伤害，更高浓度的Cd2＋进一步抑制了幼苗根的生长。幼苗的鲜重具有和芽长同样的变化趋势。

图2 Cd胁迫对匍匐剪股颖幼苗芽长、根长及整体幼苗鲜重的影响Fig.2 Effects of Cd stress on shoot length，r oot length and fresh weight of creeping bentgrass seedlings

2.2.2 Cd胁迫对匍匐剪股颖幼苗叶绿素含量的影响 随着Cd2＋浓度的增加，匍匐剪股颖幼苗叶绿素含量呈显著下降的趋势（P＜0.05）（图3）。从浓度为50 mg·L－1时开始，叶绿素含量就显著低于对照，只有对照的58%。100和200 mg·L－1处理间差异不显著（P＞0.05），但二者均显著低于CK 和50 mg·L－1处理，这表明在Cd胁迫下匍匐剪股颖幼苗叶绿素含量急剧减少，会影响幼苗对光能的吸收和利用，从而影响幼苗的正常生长。

图3 Cd胁迫对匍匐剪股颖幼苗叶绿素含量的影响Fig.3 Effects of Cd stress on chlorophyll content of creeping bentgrass seedlings

2.2.3 Cd胁迫对匍匐剪股颖幼苗SOD 和POD 活性的影响 随着Cd胁迫浓度的升高，SOD 酶活性呈“抛物线”变化，在Cd2＋浓度为50 mg·L－1时，SOD 活性达到最大，为1 314 U·h－1·g－1，是对照的1.7倍，与对照差异显著（P＜0.05）。浓度为100和200 mg·L－1Cd2＋处理的幼苗，SOD 活性较浓度为50 mg·L－1时下降，但都高于对照，分别比对照高出22%和13%（图4）；Cd胁迫对POD活性的影响与SOD相似，活性的变化整体过程也是随浓度的升高先上升后下降（图4），在Cd2＋浓度为100 mg·L－1时POD活性达到最大，为225 U·s－1·g－1，是对照的2.04倍，与对照差异显著（P＜0.05）。

2.2.4 Cd胁迫对匍匐剪股颖幼苗MDA 含量的影响 MDA 是膜脂过氧化产物，其含量高低代表过氧化的伤害程度。匍匐剪股颖幼苗中MDA 含量随着Cd2＋浓 度 的 增 高 而 不 断 升 高，50、100 和200 mg·L－1的Cd2＋处理，匍匐剪股颖幼苗MDA 含量分别是对照的5、7和9倍（P＜0.05）（图5），说明Cd胁迫强度越大，对幼苗膜系统的伤害作用越大。

2.3 Cd胁迫对匍匐剪股颖植株部分生理指标的影响

2.3.1 Cd胁迫对匍匐剪股颖植株叶绿素含量的影响 植株叶绿素含量随着Cd胁迫时间延长整体呈下降趋势，Cd2＋浓度越高下降幅度越大（图6）。处理5 d时，≥10 mg·L－1的Cd2＋浓度对叶绿素含量产生了较大影响，在10 mg·L－1时，叶绿素含量仅约为同期对照的68%；处理20 d时，2、10、50和100 mg·L－1处理的植株叶绿素含量为同期对照的86%、71%、57%和49%（图6）。

图4 Cd胁迫对匍匐剪股颖幼苗叶中SOD和POD活性的影响Fig.4 Effects of Cd stress on SOD and POD activity in creeping bentgr ass seedling leaves

图5 Cd胁迫对匍匐剪股颖幼苗叶中MDA含量的影响Fig.5 Effects of Cd stress on MDA content in creeping bentgrass seedling leaves

2.3.2 Cd胁迫对匍匐剪股颖植株SOD 和POD 活性的影响 在Cd胁迫过程中，2和10 mg·L－1的Cd2＋处理，匍匐剪股颖植株叶片SOD 活性逐渐升高，20 d时分别为同期对照的1.3和1.5倍，50和100 mg·L－1的Cd2＋处理，SOD活性在前15 d逐渐升高直到达到峰值，峰值时活性分别是同期对照的1.7和1.8倍，之后开始下降，到20 d时活性分别是峰值的86%和74%，但都高于对照（图7）。2、10和50、100 mg·L－1的Cd2＋处理引起的根部SOD活性变化趋势和叶片的SOD 活性变化趋势完全一致（图7）。

图6 Cd胁迫对匍匐剪股颖植株叶绿素含量的影响Fig.6 Effects of Cd stress on creeping bentgrass plant chlor ophyll content

Cd胁迫导致植株叶片的POD变化情况与SOD相 似（图7）。在低浓度Cd2＋处 理 下（2 和10 mg·L－1），匍匐剪股颖植株叶片POD活性总体保持升高的趋势，20 d时分别比同期对照增加了156%和100%。浓度继续升高为50和100 mg·L－1，POD活性先上升后下降，15 d时活性最高，分别为427和480 U·s－1·g－1。到20 d时活性值下降至187和320 U·s－1·g－1，分别是同期对照的1.6和2.7倍。

Cd胁迫对根部POD 活性的影响与叶片POD活性的影响存在一定的差异（图7）。Cd处理为10 mg·L－1时，POD 活性不再是一直升高，而是在15 d时达到峰值，为245 U·s－1·g－1，20 d 时降至192 U·s－1·g－1。50 和100 mg·L－1处理的POD 活性虽然总体变化趋势依然是先上升后下降，但是在10 d 时已达到峰值，分别为266 和293 U·s－1·g－1，之后开始下降，20 d时分别降至149和133 U·s－1·g－1。尽管总体变化趋势与叶片变化趋势存在一定的差异，但是各处理POD 活性和叶片一样，都大于对照。

2.3.3 Cd胁迫对匍匐剪股颖植株MDA 含量的影响 叶片中MDA 的含量随着Cd胁迫时间的延长不断上升，且随着Cd2＋浓度的增加而增多（图8）。低浓度Cd处理（2和10 mg·L－1）下，匍匐剪股颖植株MDA 含量随着Cd胁迫时间的延长与对照相比上升幅度并不是很大，而高浓度Cd处理（50 和1 0 0 mg·L－1）则使MDA含量增加，5 d时已经较对照分别增加了2 和3 倍。20 d 时，各处理MDA 含量分别是同期对照的3、5、9和14倍。

图7 Cd胁迫对匍匐剪股颖叶和根中SOD和POD活性的影响Fig.7 Effects of Cd stress on creeping bentgrass plant on SOD and POD activity

图8 Cd胁迫对匍匐剪股颖植株叶片中MDA含量的影响Fig.8 Effects of Cd stress on MDA content in creeping bentgrass plant leaves

3 讨论与结论

本试验中，Cd2＋浓度的增加导致匍匍剪股颖发芽率、芽长、根长、苗鲜重下降，而且随着Cd胁迫浓度的增加，根受到的胁迫伤害重于芽，这说明匍匐剪股颖不同器官对在Cd胁迫敏感性有差异。胁迫首先影响根系的生长和其所承担的吸收功能，进而影响到叶片等地上部分组织。Cd对根系造成伤害，原因可能是Cd造成根尖细胞分裂受阻［16］，破坏了根系细胞结构［17－18］，特别是造成根表皮细胞的崩解脱落，导致根内层细胞的死亡，降低了根的吸收能力［19］，进而降低了根的正常生理代谢，阻碍了根系生长。

叶绿素是绿色植物光合作用的主要色素，是评价草坪草叶色和观赏品质的重要指标。本研究中，随着Cd2＋浓度的增加或胁迫时间的延长，幼苗和植株叶绿素含量都呈现下降趋势。Cd胁迫下叶绿素含量下降的原因可能是进入植株体内的过量Cd抑制了叶绿素生物合成途径中几种酶活性，从而阻碍了叶绿素合成，或叶绿素分子中Mg2＋可被Cd2＋取代，或Cd2＋毒害产生过多自由基攻击直接导致叶绿素分子结构的破坏所致［13］，降解的加速和合成的减慢引起叶绿素含量降低，进而降低了植株的光合功能，导致植株生长缓慢，植株表现出矮小发黄的外部形态。

植物在新陈代谢过程中会产生有害物质活性氧·O2－，·OH 等，植物体内同样也存在着一套清除活性氧的抗氧化系统。正常情况下，植物细胞内自由基的产生与清除处于动态平衡，当植物受到外界胁迫时，体内活性氧积累的速度就会超过清除的速度。SOD 是抗氧化系统中重要的成员，是清除活性氧的第一个关键酶［20］，POD 作为活性较高的适应性酶，广泛存在于植物体内不同组织中［21］。本研究中幼苗和植株的SOD 和POD 活性在Cd胁迫下，均呈先上升后下降。Cd胁迫导致匍匐剪股颖体内产生的活性氧含量升高，抗氧化酶活性开始增加，以清除氧自由基，抵御伤害。当Cd胁迫浓度过高时，活性氧的数量超出了抗氧化酶的清除能力，导致膜系统受损，机体受到伤害，抗氧化酶的合成和其自身活性也可能受到抑制，导致匍匍剪股颖幼苗及植株生长受阻［14］。

MDA 是细胞膜脂过氧化的末端产物，常被作为脂质过氧化指标。当细胞组织受到伤害时，膜脂过氧化加剧，叶片MDA 含量增加［22］。100 mg·L－1的Cd处理使匍匍剪股颖幼苗及植株叶片中MDA 含量比对照明显增加。其主要原因可能是Cd胁迫下，体内活性氧大量积累，超出抗氧化系统的清除能力，最终引起膜脂的过氧化，产生了大量的MDA［14］。

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