胚胎植入前遗传学筛查技术的应用进展

岳佳，李永刚

（1.昆明理工大学医学院，昆明 650032；2.云南省第一人民医院生殖遗传一科，昆明 650032）

一、胚胎植入前遗传学筛查（PGS）的定义及适应症

1990年，Handyside等［1］对1例性连锁遗传病夫妇的胚胎，应用聚合酶链式反应（PCR）扩增Y 染色体特异位点后成功对植入前的胚胎进行了遗传学诊断，诞生一例健康女婴。该技术被定义为胚胎植入前遗传学诊断（PGD），即针对具有遗传病患病风险的夫妻，在体外受精（IVF）后取出胚胎6～8细胞时期的一个卵裂球进行遗传学分析，以期获得不受遗传缺陷影响的胎儿。起初只有PCR 应用于PGD，但随着荧光原位杂交（FISH）技术的引入，也可对染色体拷贝数异常进行检测。1993年，Munne等［2］首先提出对胚胎进行非整倍体的PGD，他们活检出人卵裂期胚胎的一个细胞，用多色FISH 探针对其进行非整倍体筛查。1995年，报道了第一例通过非整倍体筛查后进行胚胎移植而分娩的活婴。在IVF中，染色体数目异常的胚胎移植后会导致胚胎不能发育至足月，从而致使某些特殊不孕患者的活产率降低。因此，以期通过活检卵裂期的一个细胞，并应用FISH 技术进行染色体异常拷贝数的筛查来改善IVF的妊娠结局。该方法被定义为胚胎植入前遗传学筛查（PGS）。

众所周知，高龄女性的生育力降低大多与卵子的非整倍性相关。临床研究表明，随着女性年龄的增大，尤其是35岁后，卵子出现非整倍体的概率显著增加。这也从一定程度上解释了高龄女性无论在自然受孕还是IVF中妊娠率降低的原因。因此，从PGS的应用目的来看，高龄女性被认为是PGS最大的受益者。此外，PGS也适用于反复种植失败、复发性流产、男性因素导致的不孕、女性本身携带三体的染色体以及卵子捐赠等，因为在这些女性中也发现了高发的胚胎非整倍体［3］。近来，在年轻女性中也发现存在高发的胚胎非整倍体，Franasiak等［4］的研究表明，年龄在26岁以下的女性也有较高的胚胎非整倍性风险，因此PGS也被用于年轻女性的非整倍体筛查。对于预后良好的年轻女性，通过PGS策略选择优质的胚胎进行单胚胎移植（SET）能够降低医源性多胚带来的风险［5］。

二、PGS的应用近况

当前，根据欧洲生殖和胚胎协会（ESHRE）PGD小组的数据，植入前遗传学非整倍体筛查在欧美发达国家的辅助生育领域中已逐渐大量使用。ESHRE收集的多中心数据表明1997～1998年，全球的生殖中心仅进行了116个PGS周期，而2006年，全球57个生殖中心共进行了3 900个PGS周期［6］。但根据2009年的统计数据发现，全球60个生殖中心仅进行了3551 个PGS 周期，有略微下降的趋势［7］。

从理论上来说，选择染色体数目正常的胚胎移植可以提高种植率和妊娠率，降低流产率，提高活产率，但实际情况可能并非如此，近些年来关于PGS的争论从未停止过，且大有愈演愈烈之势。Munne和Cohen赞成对符合PGS 指征的患者实行PGS。Munne等［8］对高龄妇女行PGS 的研究表明，尽管PGS没有提高胚胎种植率，但提高了妊娠率和活产率。Gianaroli等［9］的研究表明实行PGS的高龄妇女，每个移植周期的种植率和妊娠率都有提高。PGS也能显著降低高龄妇女的流产率。而荷兰学者Mastenbroek等［10］通过一个大样本、多中心、随机双盲的研究，发现408 名年龄35～41 岁的IVF妇女中，进行PGS（取单卵裂球活检）反而明显降低了活产率，而与流产率无关。在实验组，60%的胚胎被检查出为非整倍体，提示在对照组中可能也有相似的非整倍体率。小部分嵌合型胚胎可以在发育后期自我纠正，但多数以流产告终，两组的临床流产率相似而实验组的活产率明显降低，说明PGS对于高龄妇女只是干扰了胚胎的自然选择，对妊娠结局并无益处。最近的一项对PGS研究的Meta分析也表明行PGS会显著降低高龄妇女的活产率［11］。关于PGS在IVF中的负面影响，一些学者认为实验设计以及方案存在缺陷和技术水平低下等问题是潜在的一个重要因素［12］。

三、PGS中活检方法的应用

1.极体活检：极体是卵母细胞经过两次减数分裂排出的具有与其相对应染色体组的单倍体细胞，不构成胚胎发育的部分，因此认为通过极体活检可以间接预测胚胎的非整倍性［3］。此外，在胚胎活检被法律禁止的国家，例如德国、奥地利、瑞士和意大利，极体活检是主要应用的方法［13］。其优势还在于受精卵期尚未出现嵌合体，因此可以避免胚胎嵌合体导致的误诊，并且可以提供充足的时间进行遗传学分析。关于极体活检后的妊娠率和活产率早已有报道。ESHRE 的PGS 小组初步拟定了通过极体活检来对高龄女性胚胎非整倍体进行筛查的方案，并在实验中发现极体的非整倍性和胚胎是相近的，吻合率达到94%［14］。Christopikou等［15］通过对高龄女性D3期胚胎进行极体活检和检测后也发现，其对于预测胚胎的非整倍体准确率高达98%。因此提示，通过对卵裂期胚胎的极体进行活检对于PGS是有效的。但最近，Salvaggio等［16］的一项研究表明，采用极体活检对预测胚胎的非整倍性价值不大，并没有达到预期的临床效果。作者认为，其中一个重要的原因是极体活检本身的局限性，即只能检测母源性因素导致的非整倍体，而男性因素及受精前的环境因素也能导致约10%的胚胎非整倍体。此外，有研究认为在受精过程中两个极体的存在可能与胚胎的定向发育相关联［17］。过早地进行极体活检可能会扰乱胚胎的定向分化，并在胚胎发育的晚期产生负面影响。

2.卵裂期活检：卵裂期活检是通过取胚胎发育至D3期的单个或两个卵裂球进行活检。该活检方法普遍应用于PGS，统计显示，约90%的PGS周期中应用了卵裂球活检技术［18］。但目前的一项meta分析表明卵裂球活检并不能改善PGS的妊娠结局，其中一个重要的原因是卵裂期胚胎中大量嵌合体的存在有可能导致误诊，产生假阴性或假阳性结果［11］。胚胎未分化前，约有65%～70%的胚胎存在嵌合体［19］。此外，胚胎活检损伤、技术操作失误及遗传分析方法的局限性等技术缺陷都有可能导致PGS的误诊［11］。因此，越来越多的研究倾向于应用囊胚期活检代替卵裂期活检。

3.囊胚期活检：囊胚活检已迅速成为一种更优的方法应用于非整倍体的筛查。澳大利亚的一家私人生殖中心首先采用了该方法，他们取胚胎滋养外胚层的细胞进行检测并获得了一例健康的婴儿。相对于极体活检和卵裂期活检，囊胚期活检可获取更多的细胞进行遗传学分析，可进行重复检测。此外，由于胚胎在囊胚期含有非整倍体的风险（38.8%）小于卵裂期（51%），因此采用囊胚期活检能够降低误诊率［20］。这可能是由于D2／D3期的嵌合体胚胎含有大量的非整倍体细胞，并且这些胚胎不能发育至囊胚期（由于部分非整倍体胚胎被自然淘汰）。如果胚胎中仅含有中等或低水平的嵌合体，那么当其发育至囊胚期时会进行“修复”，以致大部分胚胎获得正常的染色体型。Fragouli等［21］在研究中发现只有约1／3的囊胚存在嵌合体。Scott［22］在一项前瞻性随机对照实验中对囊胚期的胚胎进行了24条染色体的非整倍体筛查分析，并进行了新鲜胚胎的移植，结果表明该实验组的临床妊娠率为92%（12／13），高于对照组的临床妊娠率60%（9／15）。近年来，大量的研究数据表明，相比于卵裂期活检，囊胚活检更能改善PGS的妊娠结局。但目前存在的争议认为，对于高龄女性以及卵巢早衰的年轻女性，能发育至囊胚期的胚胎数量急剧减少，这就在一定程度上降低了植入率，并且有研究表明通过D3 期移植也能获得正常的妊娠［23］。

四、PGS中诊断技术的应用

1.荧光原位杂交技术：荧光原位杂交技术（FISH）作为一种较早应用于胚胎植入前遗传学筛查的技术，现已发展成熟。常规的FISH 技术可对5～14对染色体进行非整倍体筛查［24］。作为第一代PGS技术（PGS＃1）［25］，即主要应用D3 期活检结合FISH 检测，已经表明对改善IVF的妊娠结局没有益处［11］。FISH 只能在同一时间对少数染色体进行检测的局限性是导致不能改善PGS妊娠结局的一个重要原因。此外，没有实验数据证明何种探针组合是最有效的。事实上，探针的选择具有很大的随机性，并且没有大量关于卵裂期胚胎23条染色体出现非整倍体频率的实验数据。在FISH 中每个探针的检出率为92%～99%，因此在多探针的联合应用中，其误诊率是显而易见的［26］。假设每个探针的检出率为98%，那么8种探针的组合其错误率达到15%。该检测方法存在较低的阳性预测值，这会导致很多有发育潜能的胚胎被错误排除，进而影响到PGS的效能。卵裂期存在大量的嵌合体也是导致FISH 误诊风险增加的一个因素。FISH 检测过程中涉及的细胞固定和信号重叠，是导致PGS诊断错误的因素，错误率在40%～50%［27］。由于FISH技术中存在的固有缺陷，因此逐渐被新发展的检测技术所替代。

2.比较基因组杂交技术（CGH）：CGH 在PGS中的应用从染色体检测数目上弥补了FISH 的不足。CGH 能够对24条染色体进行检测，结合卵裂期活检，是最早应用于PGS 的染色体综合分析技术。采用CGH 和FISH 技术分别对D3 期胚胎中同一时间段取出的两个卵裂球进行检测，其结果证实了CGH 的可靠性，并且应用CGH 可将非整倍体胚胎的检测率从30%提高至33%［28］。但CGH 需要的检测分析时间较长（4d），超过了新鲜胚胎移植的时间（1～2d），因此需要进行胚胎冻存，而早期的冻存技术使胚胎的存活率降低，因此限制了CGH在PGS中的应用。随着玻璃化冻存（Vitrification）技术的发展，CGH 逐渐应用于极体活检和囊胚活检。Fragouli等［29］应用CGH 对极体和囊胚活检后得到的妊娠率分别为21%和69.2%，提示CGH 结合囊胚活检可以改善IVF 的妊娠结局。基于微阵列技术平台的检测技术使PGS不仅能够对24条染色体的非整倍性进行检测，并且缩短了检测时间，自动化的结果判定更加客观准确。目前，微阵列比较基因组杂交技术（aCGH）就是一种基于微阵列检测技术的比较基因组杂交技术。与FISH 相比较，aCGH 无需进行细胞固定，并且能在同一时间对全染 色 体 组 进 行 检 测。Gutierrez-Mateo 等［30］对aCGH 的有效性进行了研究，结果表明aCGH 比12种探针联合FISH 多检测出42%的异常染色体及13%的异常胚胎。而Scott等［31］进行的一项前瞻性随机双盲临床实验提到aCGH 能够将误诊率降低至4%，并且能够提高种植率和分娩率。ESHRE PGS小组对aCGH 结合极体活检的初期临床实验也表明了aCGH 在检测合子非整倍性上的准确性［14］。此外，Fiorentino等［32］的临床研究中也报道了应用aCGH 进行非整倍体筛查能得到70%的妊娠率。但aCGH 不能直接对单倍体和一些多倍体进行检测，全基因组扩增中存在的等位基因脱扣和扩增偏倚现象可能会在一定程度上降低检测效率。尽管如此，基于其较高的准确性和分辨率，aCGH 成为PGS＃2（第二代PGS）［25］主要的应用技术。但大量的实验数据证明，胚胎嵌合体的存在依然使部分具有发育潜能的胚胎被排除［14，31］，未来还需要进行一系列aCGH 结合各活检时期的随机临床实验来证实其有效性。

3.单核苷酸多态微阵列技术（SNP array）：SNP array是另一项有前景的微阵列检测技术，该技术能对24条染色体进行综合分析，其原理类似于aCGH。SNP微阵列技术不仅能够检测胚胎的非整倍性，还能对单基因缺失进行检测，并且能够提供基因型数据以生成每一个胚胎独有的DNA 指纹。目前各实验室还在对该项技术的实用性进行实验验证并已经获得了可观的结果［31］。Schoolcraft等［33］在一项临床实验中，应用SNPs结合囊胚活检得到了73%的妊娠率。近期，Tobler等［34］比较了aCGH和SNP 在PGS中的妊娠率，分别为65%和60%，提示二者都能在很大程度上改善PGS的妊娠结局。但SNP还是表现出了一定的局限性，如高成本的仪器配置，其中包括高分辨率的扫描仪以及繁琐的操作步骤。

4.二代测序技术（next generation sequencing，NGS）：现有的遗传学诊断技术仅能为PGS提供有限的分辨率和信息，很大程度上限制了非整倍体筛查与孟德尔遗传病SNP 分型及新突变位点的综合分析［35］。二代测序技术的出现为PGS提供了综合性的单细胞非整倍体筛查。NGS技术具有高通量、低成本和速度快等一系列优势。Fiorentino等［36］近期将NGS应用于PGS，证明了NGS具有临床有效性和实用性。但无论是微阵列技术还是NGS，都必须基于PCR 技术，因此单细胞基因组扩增成为NGS技术的关键。多重置换扩增技术相对于其他的PCR 技术能够提供更高的准确性，但依然存在大量的扩增偏倚。哈佛大学的一个研究团队最近提出了MALBAC（multiple annealing and looping-based amplification cycles）技术，即多次退火环状循环扩增技术，该技术具有更高的扩增均一性［37］。MALBAC已被用于单个卵母细胞的基因测序［38］。第三代测序技术（de novo sequence），即单分子实时DNA 测序具有更高的检测速度与较长的读长，逐渐成为研究的热点方向。

5.延迟监测（time-lapse monitoring，TLM）技术：延迟监测技术，即利用延时摄像技术对胚胎体外发育过程进行全程监测，根据胚胎发育过程中出现的分裂异常、核重现、多核等现象，初步评价囊胚形成能力和囊胚的染色体组成。常规的胚胎形态学评级方法仅限于在胚胎发育的某一时刻进行观察评估，并且在操作过程中需要将胚胎暴露在变化的环境中。TLM 在IVF中应用弥补了常规评级方法的不足，通过每5-20分钟一次的图像采集来对早期胚胎的发育进行连续评估，因此避免了依靠静态观察来 定义一个 动 态 过 程［39］。近 来，TLM 在IVF 中 的应用使得无创性PGS（noninvasive-preimplantation genetic screening，NPGS）成为了可能，所谓无创性PGS，即不进行胚胎活检的条件下筛选出染色体正常的胚胎进行移植［40］。TML 在PGS 中的应用能够筛选出具有良好发育潜能的胚胎，并获得低比率的非整倍体胚胎。Meseguer等［41］在研究中提出，胚胎的形态发育动力学能够为评估胚胎的发育潜能提供新的形态发育动力学标记（morphokinetic markers），以此来评估胚胎的生长发育潜能并为判断胚胎的非整倍体提供依据。一项系统性的回顾分析显示，几个胚胎发育的动力学参数与后续移植的成功率有显著的相关性，例如从受精到发育至第五天的时间间隔、两次卵裂的时间间隔等［39］。Hong等［42］在研究中发现，胚胎出现非整倍体的风险随着囊胚出现胚泡的时间缩短而降低。而在另一项研究中，Basile等［43］应用胚胎发育早期的几项形态动力学参数建立模型来提高筛选出正常染色体数目胚胎的可能性。Campbell等［44］应用TLM 建立了胚胎非整倍体风险评估模型，利用该模型选择低风险的胚胎进行移植，得到了较低的非整倍率。在最近的一项研究中，通过比较TLM 联合array CGH 的策略与常规的PGS方法，结果显示两种方法的联合应用能够获得更高的种植率和妊娠率［45］。

五、PGS的发展前景

PGS发展至今已走过近20 年的历程，在其发展的前15年中取受精后第3天卵裂期胚胎的1～2个细胞进行FISH 分析成为PGS的常规方法，但随后几年的几项随机控制实验却表明PGS不能在很大程度上改善IVF的妊娠结局，且在这些实验中多采用种植率作为参考标准。因此，美国生殖医学学会（ASRM）、欧洲人类生殖与胚胎协会（ESHRE）以及英国生育协会（BFS）等机构认为没有证据表明PGS在常规IVF 周期中的作用是积极的。尽管前期的临床实验并未给PGS带来可观的应用前景，但也没有阻碍PGS技术的发展，新遗传分析技术的出现为PGS带来了新的机遇与挑战。目前，囊胚期活检联合aCGH 的全染色体组综合分析成为PGS的主要发展趋势，但依然需要考虑其中涉及的效力和成本问题。此外，PGS在IVF中的应用更多的倾向于“以治疗为目的”（intended to treat），因此在评估各活检方法联合遗传分析方法的临床效益时，应赋予继续妊娠率甚至健康婴儿出生率更高的权重，并且同时考虑患者所负担的医疗费用。未来需要进行更多的临床实验来确定胚胎植入前各筛查技术的有效性，或探究多方法的联合应用以改善IVF的妊娠结局。

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