α-胡萝卜素降解产香菌株的分离、鉴定及发酵条件优化*

贾蓓蕾，魏涛，黄申，贾春晓，杨靖，张改红，白冰，毛多斌

(郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州，450002)

类胡萝卜素是由8个类异戊二烯单元组成的多烯类物质，是C40类萜化合物及其衍生物的总称，呈黄色、红色或橙红色［1］。常见重要类胡萝卜素有α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、六氢番茄红素、八氢番茄红素和叶黄素等。类胡萝卜素经过酶催化或光氧化可分解产生 C-13，C-11，C-10，C-9 衍生物，包括 α-紫罗兰酮、α-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯和β-大马酮等重要的香料物质，在制备食品用香精和香料方面具有重要应用价值［2-3］。

目前对于类胡萝卜素降解方法主要有物理法和化学法［4-5］，其中物理降解条件不够温和，化学方法没有选择性。生物降解法是近年发展起来的高效降解类胡萝卜素方法，该方法不仅具有高度选择性，而且微生物种类多、含酶丰富，可进行多种生物转化反应。到目前为止，β-胡萝卜素生物降解及其香味产物的研究较多，而α-胡萝卜素和叶黄素相关研究还较少［6］。本文利用微生物学方法从烟叶中筛选到α-胡萝卜素降解菌株Saccharomyces cerevisiae strain ULI3，并优化了该菌株发酵液降解α-胡萝卜素的活性，为类胡萝卜素生物降解以及降解产物工业化应用打下坚实基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

筛菌样品:玉溪KC3F烤烟烟叶，产地云南。

试剂及仪器:α-胡萝卜素标样(百灵威科技有限公司);α-胡萝卜素底物(纯度90%，陕西帕尼尔生物科技有限公司);GC-MS色谱联用仪(Agilent 7890C，Agilent公司);梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)，2600 UC/VIS紫外可见分光光度计(美国UNIC公司);冷冻离心机(J6-MI，美国Beckman公司)。

富集培养基［7］:K2HPO4(1 g/L)、MgSO4·7H2O(0.5 g/L)、NaNO3(3 g/L)、FeSO4·7H2O(0.01 g/L)、KCl(0.5 g/L)、蔗糖(30 g/L)、酵母浸粉(3 g/L)。

发酵培养基、分离培养基:在富集培养基基础上添加 15 g/L α-胡萝卜素。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种的筛选［8］

1.2.1.1 初筛

称取10 mg烟叶于250 mL三角瓶中，加入100 mL无菌水浸泡24 h，抽滤，取滤液2 mL加到富集培养基中，28℃、转速150 r/min培养2 d，得到菌源。取适量菌源进行梯度稀释，选择10-3，10-4，10-5三个浓度梯度在分离培养基上进行平板涂布，每个浓度梯度平行涂布3个平板，同时对不含有底物α-胡萝卜素的平板进行涂布作为对照组。将涂布好的平板于培养箱中28℃培养2～3 d，挑选出形态较好，有透明圈产生的单菌落，反复进行划线分离纯化。

1.2.1.2 复筛

挑选出透明圈较为明显的单菌落接种于100 mL发酵培养基中28℃、转速150 r/min培养2 d，通过观察摇瓶颜色，以及GC-MS分析检测降解产物，进一步筛选具有降解α-胡萝卜素能力的菌株。

1.2.2 GC-MS分析检测降解产物［9］

1.2.2.1 降解产物萃取

取100 mL发酵液，于250 mL分液漏斗中加入等体积的分析纯二氯甲烷，缓缓摇晃，使两相混合均匀，静置20 min后收集有机相，重复以上步骤3次，合并有机相，旋转蒸发除去二氯甲烷后，加入1 mL色谱纯二氯甲烷溶解，过0.22 μm有机系滤膜后，于4℃低温储存备用，以上操作均在避光环境中进行。

1.2.2.2 降解产物分析检测［10］

色谱条件:HP-5色谱柱30m×0.25mm×0.25μm;载气为氦气，流速为1mL/min;程序升温:40℃，保持2.5 min，以2℃/min的升温速度升至280℃并保持5 min;进样量为2 μL;分流比为0。

MS分析条件:溶剂延迟6 min，质谱扫描范围35～455 aum，传输线温度280℃，离子源为EI源，EI电子能量70 eV。定性和定量分析时，分别采用全扫描(Scan)和选择离子扫描(SIM)模式。

1.2.3 降解产物降解率测定

α-胡萝卜素储备液的配制［11］:避光条件下，称取1 mg α-胡萝卜素，溶于5 mL的分析纯二氯甲烷中，待α-胡萝卜素彻底溶解后加入0.1 g Tween-80进行乳化，减压浓缩除去二氯甲烷，得到分散均匀的胡萝卜素，加入10 mL无菌水溶解得到0.1mg/mL α-胡萝卜素储备液，待用。

α-胡萝卜素标准曲线的制备:分别量取0、30、50、100、200、400、500、700、800、900 μL α-胡萝卜素储备液于10支25 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，分光光度法测460 nm处吸光度，以蒸馏水为空白对照，根据所得数据制定标准曲线。得到线性方程为y=0.276 5x+0.005(R2=0.999 9)。式中，x为 α-胡萝卜素水溶液浓度，μg/mL;y为α-胡萝卜素水溶液的吸光度。

降解率的测定:采用分光光度法。以培养基作为空白对照，在发酵培养基中加入1 mL浓度为1 mg/mL的α-胡萝卜素储备液，分别在发酵前和发酵24 h后测定吸光度，其降解率按公式(1)计算:

1.2.4 菌株鉴定［12］

1.2.4.1 形态观察

菌体经过结晶紫染色2 min后，分别在低倍镜与高倍镜下观察菌株形态。

1.2.4.2 ITS序列扩增、测序及系统发育分析

用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取目标菌株基因组DNA，PCR反应引物为真菌 ITS序列通用引物5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(正向)和5'-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3’(反向)，引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系:10 μL 10×PCR buffer，1μL 基因模板，5 μL 2.5 mmol/L dNTP Mixture，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，1 μL Tag酶，81 μL无菌水。测序由上海生物工程有限公司完成。系统发育分析根据其16S rRNA基因序列用

MEGA5.1软件构建系统进化树，使用Neighbor-Joining法进行1 000次步长计算。

1.2.5 菌株发酵培养条件的优化［13］

1.2.5.1 碳源影响

选择蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖和果糖5种碳源，其余成分相同(发酵培养基)，比较α-胡萝卜素降解能力，选择最佳碳源。

根据所选择的最佳碳源，取其不同质量浓度(10、30、50、70、90 g/L)进行培养，研究碳源质量浓度对α-胡萝卜素降解能力的影响。

1.2.5.2 氮源影响

在最佳碳源条件下，选择NaNO3、(NH4)2SO4、胰蛋白胨和尿素4种氮源，比较其α-胡萝卜素降解能力，确定最佳氮源。

根据所选择的最佳氮源，取其不同质量浓度(1、3、5、7、9)进行培养，研究氮源质量浓度对 α-胡萝卜素降解能力的影响。

1.2.5.3 酵母粉影响

在最佳碳源和氮源条件下，比较不同浓度酵母粉(1、3、5、7、9)对 α-胡萝卜素降解能力的影响。

1.2.5.4 初始pH值影响

选择最佳浓度碳源、氮源、酵母粉配制发酵培养基，设置不同 pH 值(5、6、7、8、9)，比较胡萝卜素降解率，确定最佳初始pH值。

1.2.5.5 正交试验的设计

根据单因素实验结果，选择4个影响较大因素进行4因素3水平L9(34)正交试验。

2 结果与讨论

2.1 α-胡萝卜素降解菌的筛选

从烟叶中共筛选到5株降解α-胡萝卜素的菌株，分别接种于含有α-胡萝卜素底物的发酵培养基中进行发酵培养，根据分光光度法分别测定其降解能力。由图1可知，菌株ULI3的α-胡萝卜素降解能力最高，其降解率为89.74%。α-胡萝卜素在菌株ULI3作用下形成多种降解产物，经GC-MS分析(图2)检测出28个挥发性的化合物，主要包括酮类、醛类、醇类、烯烃类、芳烃类以及少量的酸类和酯类化合物。其中，5，6-环氧-β-紫罗兰酮(6.15%)、β-紫罗兰酮(5.1%)、二氢猕猴桃内酯(3.12%)、2-羟基-3，5，5-三甲基-2-环己烯酮(1.69%)、异佛尔酮(1.51%)、β-环柠檬醛(1.1%)、2，6，6-三甲基-1-环己烯基乙醛(0.8%)、2，2，6-三甲基环己酮(0.64%)等是重要的香料物质(表1)。因此，菌株ULI3具有降解α-胡萝卜素产香的能力，可以作为模式菌株研究α-胡萝卜素降解及产物分析。

2.2 菌株鉴定

2.2.1 形态特征

将菌株ULI3接种于固体培养基，培养36 h后长出菌落，48 h后平板颜色基本褪完(如图3所示)。菌落表面有光泽，边缘整齐，中心有隆起;染色后在光学显微镜(×100或×400)下观察，菌体多为椭球形和卵形，直径5～10 μm，进行单极出芽生殖(如图3所示)。

2.2.2 进化树分析

利用真菌ITS rDNA特征性引物对菌株ULI3基因组进行PCR扩增，得到820 bp目的序列。NCBI Genbank数据库中进行blast同源序列分析，发现菌株ULI3与酵母属(Saccharomyces)具有98%以上的同源性。系统进化树结果表明(如图4所示)，菌株ULI3与酿酒酵母聚为一类。初步鉴定菌株ULI3为酿酒酵母(S.cerevisiae)。

2.3 菌株ULI3发酵培养基的优化

2.3.1 碳源影响

由图5可知，对α-胡萝卜素降解率而言，蔗糖＞乳糖＞麦芽糖＞葡萄糖＞果糖，蔗糖作为碳源降解效果明显优于其他碳源。蔗糖作为非还原性双糖，可以缓慢被菌体利用，既提供了菌体生长必需的碳源和能量，又能保证菌体充分降解α-胡萝卜素底物。葡萄糖是还原性单糖，可以快速被菌体彻底利用，从而导致胡萝卜素降解率偏低。乳糖和淀粉不易水解，因此也不容易被利用。

由图6可见，蔗糖浓度对降解率有比较明显的影响。在蔗糖浓度10～30 g/L内，其降解率随着蔗糖浓度的增加而增高，当蔗糖质量浓度为30 g/L时，其降解率最高，之后，随着蔗糖浓度增加，降解率呈现下降趋势。实验结果表明，蔗糖质量浓度在30 g/L以下时，碳源浓度偏低，不能保证菌体的正常生长，从而也达不到最优降解效果。当碳源质量浓度在30 g/L以上时，菌体优先利用充足的蔗糖，因此不能很好地降解胡萝卜素底物，并且会随着蔗糖浓度的增加，降解效果会越来越差。蔗糖为30 g/L时，菌体既能正常生长，又能彻底降解底物。因此，蔗糖最佳质量浓度为3%。

2.3.2 氮源影响

由图7可以看出，菌株ULI3在以NaNO3为氮源的培养基中，对α-胡萝卜素的降解能力最高。不同质量浓度(1、3、5、7、9 g/L)NaNO3对降解率影响明显(如图8所示)。NaNO3质量浓度低于3 g/L时，其降解率随着NaNO3浓度的增加而增高，NaNO3为3 g/L时，降解率最高，NaNO3高于3 g/L时，降解率呈下降趋势。氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累。因此，选择氮源NaNO3最佳质量浓度为3 g/L。

2.3.3 酵母粉影响

由图9可以看出，酵母粉对降解率的影响很明显。菌体在酵母粉浓度为0.3%的培养基中，对α-胡萝卜素的降解能力最高，随着酵母粉浓度的减小或增大，降解率变低。酵母粉浓度为0.3%时，既给菌体补充了足够的营养，保证菌体正常生长，又能彻底降解底物。因此，酵母粉的最佳浓度为0.3%。

2.3.4 初始pH值影响

从图10可以看出，发酵液的初始pH对降解率影响很大，在初始pH＜8时，菌种降解能力随pH的增大而升高，初始pH＞8时，降解率大幅度下降。因此，确定菌株ULI3最适初始pH为8。

2.3.5 正交试验结果

根据单因素实验结果，选取蔗糖浓度、NaNO3浓度、酵母粉浓度和初始pH值4个因素进行正交试验。具体水平设置见表2。

由表3可以看出，极差R的大小依次为C＞B＞D＞A，这说明因素对降解率的影响顺序是酵母粉浓度＞氮源浓度＞起始pH＞碳源浓度。根据表4方差分析结果可知酵母粉对降解率影响显著。由所得数据得最优发酵条件为A2B3C2D2，即蔗糖浓度30 g/L，硝酸钠质量浓度4 g/L，酵母质量粉浓度3 g/L，起始pH值为8。在此最佳条件下进行验证试验，α-胡萝卜素降解率为97.13%。

正交试验结果见表3。方差分析结果见表4。

3 结论

从烟叶中筛选到1株高效降解α-胡萝卜素的菌株ULI3，在含有α-胡萝卜素(15 mg/L)发酵培养基中进行降解，α-胡萝卜素降解率达到89.74%，其中降解产物主要是 5，6-环氧-β-紫罗兰酮、β-紫罗兰酮和二氢猕猴桃内酯等香味物质。通过经典形态学和ITS序列系统进化树分析，初步鉴定菌株ULI3为酿酒酵母(S.cerevisiae)。在研究蔗糖浓度、NaNO3质量浓度、酵母粉浓度和初始pH各单因素实验基础上，采用正交实验得出了菌株ULI3培养液降解α-胡萝卜素的最佳培养条件:蔗糖质量浓度30 g/L，NaNO34 g/L，酵母粉3 g/L和初始pH值为8。采用该培养条件，α-胡萝卜素降解率达到97.13%。类胡萝卜素生物降解及降解产生香味物质在食品、香料和化工领域具有广泛应用前景。

［1］ 李福枝，刘飞，曾晓希，等.天然类胡萝卜素的研究进展［J］.食品工业科技，2007，28(9):227.

［2］ Marie F N，De Gaulejac N V，Nicolas V，et al.Characterization of carotenoids and degradation products in oak wood incidence on the flavour of wood［J］.Comptes Rendus Chimie，2004，7(16):689.

［3］ 秦艳青，李爱军，杨兴友，等.α-胡萝卜素的降解方法及其降解物在卷烟加香中的应用［J］.江苏农业科学，2014，42(5):220-222.

［4］ Rao A V，Rao L G.Carotenoids and human health［J］.Pharmacological Research，2007，55(3):207-216.

［5］ Kaneko H，Harada M.4-Hydroxy-β-damascone and 4-hydroxydihyro-β-damascone from cigar tobacco［J］.Agricultural Biology Chemistry，1972，36(1):168-171.

［6］ 许春平，王铮，郑坚强，等.类胡萝卜素降解方式的研究综述［J］.郑州轻工业学院学报:自然科学版，2012，27(4):56-59.

［7］ 麻俊侠，樊明涛，王树林，等.α-胡萝卜素降解葡萄球菌化学合成培养基营养素的研究［J］.食品科学，2013，34(5):137-141.

［8］ 许春平，杨琛琛，王铮，等.低次烟叶中的类胡萝卜素降解研究［J］.郑州轻工业学院学报:自然科学版，2013，28(6):1-5.

［9］ Zorn H，Langhoff L，Scheibner M，et al.Cleavage of β，βcarotene to flavor compounds by fungi［J］.Appl Micobiol Biotechnol，2003，62(4):331-336.

［10］ Sanchez-Contreras A，Jimenez M，Sanchez S.Bioconversion of lutein to products with aroma［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2000，54(4):528-523.

［11］ Schepartz A I，Mottola A C，Schlotzhuer W S，et al.Effect of ozone treatment of tobacco on leaf lipids and smoke PAH:A pilot plant trail［J］.Tabacco Science，1995，25:120.

［12］ 许甜甜.苯酚降解菌的分离鉴定及苯酚降解的相关研究［D］.上海:上海师范大学，2012.

［13］ 金国英.酵母类胡萝卜素产生菌的筛选及其发酵条件的研究［D］.杭州:浙江大学，2001.