采用ATP生物发光法分析6株常见细菌ATP含量差异

田雨，侯玉柱，柯润辉，尹建军，宋全厚

(中国食品发酵工业研究院，北京，100027)

ATP生物发光法是新近发展起来的一种微生物快速检测技术［1］，具有快速、简单、经济的特点［2］，目前主要应用在食品生产企业的日常卫生管控方面［3-4］，它与涂抹法结合可快速测定食品生产加工环节各个卫生关键控制点的卫生状况［5-6］，快速评估，及时发现问题，降低微生物污染发生的可能性［7-8］。

由于ATP生物发光法无法定性鉴别细菌种类［9-12］，因此不同细菌 ATP 含量是否一致［13-14］，对该方法的检测结果影响较大。鉴于此，本研究以ATP生物发光法为基础，辅以GB4789.2-2010方法，选择大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、乳酸链球菌、乳酸片球菌等6种常见细菌，分析和对比不同常见细菌中ATP含量的差异性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株

大肠埃希氏菌(CICC10389、CICC20234);枯草芽孢杆菌(CICC10275);蜡状芽孢杆菌(CICC20511);乳酸链球菌(CICC20711);乳酸片球菌(CICC20719)。

1.1.2 仪器与试剂

ATP荧光检测仪(SF0012型)，购于中质赛福(北京)科技仪器有限公司;恒温培养箱;涡旋振荡器;高压灭菌锅。

ATP标准品(三磷酸腺苷二钠盐);复合荧光试剂(产品编号ZF0011)，购于中质赛福(北京)科技仪器有限公司;平板计数琼脂培养基(PCA);无菌生理盐水;无菌水。

1.2 实验方法

1.2.1 建立6株细菌的菌落总数(CFU/mL)与ATP荧光值(RLU/50μL)的数学模型

自冷藏的斜面培养基中挑取6株细菌——大肠埃希氏菌(CICC10389、CICC20234)、枯草芽孢杆菌(CICC10275)、蜡状芽孢杆菌(CICC20511)、乳酸链球菌(CICC20711)、乳酸片球菌(CICC20719)，分别划线接种于培养皿中，36℃培养24 h。将10 mL无菌生理盐水注入已划线培养24 h的平皿培养基表面，打散其上的菌落并收集于无菌玻璃试管中，振荡摇匀，作为菌悬液原液。吸取每株细菌的菌悬液原液各1 mL放入无菌玻璃试管中，加4 mL生理盐水混合均匀，配制成稀释度为10-1的6株细菌的混合液。以无菌生理盐水10倍梯度稀释各细菌的菌悬液原液及其混合液，配制成10-1～10-8梯度稀释菌液。吸取 10-6、10-7、10-8梯度稀释菌液各 1 mL，按照GB4789.2-2010测定其菌落总数。再吸取各菌株及其混合菌液的梯度稀释液各50 μL于样品杯中，加25 μL复合荧光试剂，放入ATP荧光检测仪中测定其荧光值。以菌液的菌落总数(CFU/mL)及ATP荧光值(RLU/50μL)建立数学模型。

1.2.2 建立ATP标准溶液浓度与其荧光值的数学模型

称取ATP标准品0.055 1 g，以无菌水定容于100 mL容量瓶，即得10-6mol/mL的ATP基础溶液。吸取ATP基础溶液1 mL，以无菌水定容于100 mL容量瓶，即得10-8mol/mL的ATP基础稀释溶液。对10-8mol/mL的ATP基础稀释溶液进行10倍梯度稀释，配制浓度为10-9～10-13mol/mL的ATP标准系列溶液。吸取ATP标准系列溶液各50 μL于样品杯中，加25 μL复合荧光试剂，以微量荧光检测仪测定其荧光值。根据ATP标准系列溶液的浓度(mol/mL)与相应的荧光值(RLU/50μL)，建立数学模型。

2 结果与分析

2.1 各细菌的ATP荧光值(RLU/50μL)与菌落总数(CFU/mL)的关系

分别测定大肠埃希氏菌(CICC10389、CICC20234)、枯草芽孢杆菌(CICC10275)、蜡状芽孢杆菌(CICC20511)、乳酸链球菌(CICC20711)、乳酸片球菌(CICC20719)等6株细菌的ATP荧光值和菌落总数，由于每次可测得5～6对数据，为获得统计学中的大样本数量(n≥30)，多次重复测定，保证每株细菌测得30对或30对以上的数据用于建立数学模型。表1内是6株细菌及其混合菌液的菌落总数对数值［log10(CFU/mL)］与ATP荧光值对数值［log10(RLU)］的数学模型，由表1的数学模型，可计算出6株细菌在相同荧光值下对应的菌落总数，见表2。

表1 六株细菌的菌落总数与ATP荧光值的数学模型Table 1 Mathematical models between aerobic plate count and ATP fluorescence value of six strains

表2 六株细菌及其混合物在不同ATP荧光值下的菌落总数CFU/mLTable 2 Aerobic plate counts of six strains and their mixture with different ATP fluorescence values CFU/mL

由表2可知，当荧光值为100时，6株细菌及其混合物的菌落总数基本维持在104CFU/mL左右，并且随着荧光值的10倍递增，菌落总数也呈现10倍递增趋势，当荧光值达到1 000 000(仪器的最大量程为7位数)时，菌落总数始终保持在108CFU/mL的水平。因此，当荧光值相同时，无论是单一纯菌样品还是含有多种混合细菌的样品，其菌落总数都保持在相同或相近的数量级上。

为了进一步确认在ATP荧光值均相同的情况下，6株细菌及其混合菌液的菌落总数是否存在明显差异，对表2中6株细菌的菌落总数进行无重复的双因素方差分析，结果见表3。

由表 3可知，F行=8.13＞F行crit=2.87，P=4.62×10-4＜0.05，表示当 ATP荧光值(在100～1 000 000RLU/50 μL范围内)数量级不同时，实验所用的6株细菌的菌落总数有明显差异。即ATP荧光值的数量级对各细菌的菌落总数有显著影响。而F列=1.31＜F列crit=2.71，P=0.30＞0.05，表示当 ATP荧光值(在100～1 000 000 RLU/50μL范围内)相同时，各细菌的菌落总数无显著差异。即细菌的种类虽然会导致ATP生物发光法所测得的菌落总数各不相同，但差异并不明显，不会对菌落总数的报告结果产生显著影响。

表3 六株细菌在相同荧光值下的菌落总数的无重复双因素方差分析CFU/mLTable 3 No repeat two-way ANOVA of aerobic plate counts of six strains and their mixture with same ATP fluorescence value CFU/mL

2.2 ATP浓度与荧光值的关系

表4 ATP标准溶液浓度与相应的荧光值Table 4 Concentration of ATP standard solution and their fluorescence value

根据ATP浓度的对数值和荧光值的对数值建立数学模型，如图1。

图1 ATP标准溶液浓度与其相应荧光值的数学模型Fig.1 A mathematical model between concentration of ATP standard solution and their fluorescence values

可知ATP含量与其荧光值的相关数学模型为:

Y=0.968 5X+15.443 4

其中，Y为ATP荧光值的对数值［log10(RLU)］;X为ATP标准溶液浓度的对数值［log10(mol/mL)］;二者相关系数(R2)为0.994 3，数学模型线性良好。

2.3 各细菌的菌落总数与ATP浓度的关系

将ATP浓度与荧光值的数学模型Y=0.968 5X+15.443 4(见图1)代入表1中的6株菌落总数与荧光值的数学模型，可推导出株菌落总数对数与ATP浓度对数值的数学模型，见表5。

表5 六株细菌的菌落总数与ATP含量的数学模型Table 5 Mathematical models between aerobic plate count and ATP content

根据表5中的数学模型，可计算不同菌落总数水平下的各细菌ATP含量(mol)。但由于受本研究所使用的ATP荧光检测仪量程所限(见表2)，仅选取104～108CFU/mL(与ATP荧光检测仪100～1 000 000 RLU的量程相对应)共5个数量级的菌落总数，代入表5的数学模型进行计算。

表6 六株细菌在不同菌落总数下的ATP含量Table 6 ATP contents of six strains with different aerobic plate counts

由表6可知，6株细菌的ATP含量均随菌落总数的10倍增长而逐级提高，当菌落总数为104CFU/mL时，6种细菌的ATP总量基本都在10-14mol/mL的水平。当菌落总数为108CFU/mL时，6种细菌的ATP总量基本都在10-10mol/mL的水平。虽然大部分细菌的ATP总量并不是绝对严格地随菌落总数的10倍递增，其两位有效数字往往有所不同;但当菌落总数相同时，各细菌的ATP含量都在相同或相近的数量级上。

为确定在菌落总数均相同的情况下，6株细菌的ATP总含量是否存在显著差异，对表6中的数据进行无重复的双因素方差分析，结果如下:

由表7可知，F行=10.11＞F行crit=2.87，P=1.21×10-5＜0.05，表示当菌落总数的数量级(1～108CFU/mL)不同时，实验所用的6株株细菌的ATP总含量有明显的差异。即菌落总数的数量级对各细菌的ATP总含量有显著影响。而F列=1.24＜F列crit=2.71，P=0.33＞0.05，表示当菌落总数相同时，不同细菌的ATP含量无明显差异。即细菌的种类不会对ATP生物发光法所测得的各细菌的ATP总含量产生显著影响。而根据图1中的数学模型，ATP含量与其荧光值线性相关(R2=0.994 3)，因此虽然6株细菌种属不同，但当其菌落总数相同时，所测定的ATP荧光值无明显差异。

表7 六株细菌在不同菌落总数下的ATP含量的无重复因素方差分析mol/LTable 7 No repeat two-way ANOVA of ATP contents of six strains with different aerobic plate counts mol/L

3 结论

目前，对ATP生物发光法的研究，多集中在温度、pH值、提取剂等外在因素对微生物检测结果的影响［15-16］，关于不同种类细菌中ATP含量的研究较为稀少［17］。张国龙［18］、张虹妍［19］等为了验证抗结核药物的作用，曾以ATP生物发光法测定结核分枝杆菌的ATP含量，但并未横向比对不同细菌种类之间的差别。本研究分析和比对了大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、乳酸链球菌、乳酸片球菌等6株常见细菌的ATP含量，这对ATP生物发光法的实际应用具有重要意义——在使用该方法快速检测样品的细菌数量时，可以忽略体积相似或相近的细菌的种属差异，根据数学模型推算菌落总数，为食品生产加工企业的卫生管控提供快速、准确的技术支撑。

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