凝胶色谱分离-柱后染色法快速鉴别橙汁掺假*

牛灿杰，陈小珍，张慧，王展华，马千里，徐生坚

1(浙江省质量检测科学研究院，浙江杭州，310013)2(浙江工业大学化学 工程学院，浙江 杭州，310014)

随着人们生活水平的提高，果汁饮料需求量及消费量逐年增长。然而国际市场上60%～80%的果汁易存在掺假，究其原因是利益驱使及检测技术的落后。目前，研究报道的果汁鉴别检测方法多以糖类［1］、有机酸［2］、黄酮类［3］、氨基酸［4］、无机元素［5］等物质为研究对象，这些物质具有价廉易被添加、不能体现果汁整体性质且易受产地影响等缺点。已有研究［6-8］表明，果汁中的可溶性蛋白质具有稳定不易受工业流程影响、无经济利益不易被添加等特点，有望用于果汁掺假鉴别。由于果汁体系复杂，具有完整性、稳定性优势的特征指纹图谱成为果汁质量控制的研究方向［9-11］。

我国现有的用于橙汁检测的标准方法为GB/T 12143-2008《饮料通用分析方法》，然该方法需测定6项指标并经过复杂的计算，且主要用于橙汁含量的定量检测，关于橙汁掺假快速鉴别方法的研究仍然缺乏。

本文以橙汁中的的可溶性蛋白质为研究对象，采用凝胶色谱柱分离柱后复合考马斯亮蓝染色法，分离橙汁中分子质量大于1 000Da的蛋白质，实现橙汁蛋白质按分子量分布的连续检测，建立橙汁中可溶性蛋白质的特征指纹图谱，可用于鉴别橙汁真伪。该方法简单、快速、干扰小。

1 材料与方法

1.1 实验材料

橙汁主产区［12］的纯正浓缩果汁，江西浓缩橙汁(64.9Brix)，四川浓缩橙汁(64.9Brix)，均储存于-18℃;市场上随机抽取的不同产地橙汁饮料(果汁标签上均有注明橙汁含量≥10%)12种，均储存于-4℃;橙子鲜榨汁，葡萄鲜榨汁，西瓜鲜榨汁、橘子鲜榨汁均由水果经榨汁机榨汁后用滤纸过滤，储存于-4℃。

1.2 实验仪器

1.2.1 检测仪器

浙江省质量检测科学研究院和杭州新材料科技有限公司联合研制的果汁蛋白质检测仪。

1.2.2 仪器原理

果汁蛋白质检测仪的原理是蛋白质经凝胶过滤色谱柱分离后，按分子质量依次流经混合器，与考马斯亮蓝染色剂染色形成蛋白质 色素络合物，该物质在595nm具有最大吸收，经光谱检测仪检测，将所得吸光度值转换为电压信号传送到计算机(见图1)。

图1 果汁蛋白质快速检测仪器结构示意图Fig.1 The structure diagram of the detecting instrument

1.2.3 色谱工作站及蛋白质分子量标尺

果汁蛋白质特征图谱通过配备的色谱工作站获得，除采用保留时间定性外，色谱工作站中含有蛋白质标尺(采用标准蛋白质定标获得)辅助定性。

1.3 实验方法

1.3.1 100%橙汁样品的制备

将可溶性固性物为64.9 Brix的高倍浓缩橙汁，稀释还原为11.6 Brix的标准浓缩还原汁，以此作为标样，标样制备过程中只加入果汁浓缩时失去的天然水分等量的水。

橙子鲜榨汁经滤纸过滤滤去果渣，余下橙汁备用。

1.3.2 果汁含量和总氮含量的测定

橙汁原果汁含量按照GB/T 12143-2008《饮料通用分析方法》进行检测;橙汁中蛋白质含量按照GB 5009.5-2010《食品中蛋白质的测定:第一法——微量凯式定氮法测定粗蛋白含量》进行测定。

1.3.3 样品处理与检测

果汁用定量滤纸过滤并经超声仪脱气后，取5mL样液用手动进样器进样，果汁蛋白质检测仪进行检测。

2 结果与分析

2.1 样品果汁含量和总氮含量的测定

不同产地样品的果汁含量和总氮含量的结果见表1，其中，编号为“12”的样品未检测出果汁含量。

表1 不同产区果汁含量及全氮含量Table 1 Content and total nitrogen content of juice in different regions

2.2 浓缩还原橙汁标准样品蛋白质指纹图谱

橙汁标准样品A、B、C的蛋白质指纹图谱见图2。

图2 橙汁标准样品图谱Fig.2 The spectrometry of standard samples

图谱具有4个特征峰，分别标记为第“1”、“2”、“3”、“4”峰，“1”峰的出峰时间为 20 ～50min，分子质量约为7.5 ×104Da，其余3 个峰(“2”、“3”、“4”峰)的出峰时间位于70～100min，分子质量约为0.5×104～1.0×104Da。

不同产区的标准样品“1”峰的出峰时间及对应分子质量基本相似，而分子质量位于0.5×104～1.0×104Da的“2”、“3”、“4”峰，出峰时间及蛋白质分子质量具有极小差别，可能是由于地区差异及果汁制作技术(实验室配制与工业工艺流程的差异)的影响引起的，但整体上，鲜榨汁与2个不同地区的浓缩还原橙汁的蛋白质指纹图谱，具有很高的相似性。

2.3 国内不同产地的商品橙汁饮料蛋白质指纹图谱

国内不同产地的商品橙汁饮料蛋白质指纹图谱见图3。

图 3 中“1#”、“2#”、“3#”、“4#”、“5#”分别是编号为1、2、3、4、5的商品橙汁饮料(样品信息见表1)，由于编号为7、8、11的样品与编号为5的样品图谱非常接近，编号为6、9的样品图谱与编号为2的样品图谱非常接近，样品10与样品4非常接近，因此省略。

图3显示，国内不同产地的商品橙汁饮料蛋白质谱图与标准样品的谱图(图2)规律相同，且图3中“2”、“3”、“4”峰的出峰时间及分子量分布基本一致。

同时，商品样品与标准样品图谱规律相同，表明果汁中的添加剂并不干扰蛋白质指纹图谱，这是由于考马斯亮蓝染色法不受脂肪、多糖、维生素、游离氨基酸和酚类物质的干扰［12-13］。而橙汁中其他常见添加物，如甜味剂(葡萄糖、蔗糖等)、有机酸(如苹果酸、柠檬酸等)，具有分子质量小且595nm无吸收的特点，经凝胶过滤色谱柱分离后不干扰特征峰的检测。因此，橙汁饮料中蛋白质按分子量分布的特征指纹图谱抗干扰能力强、稳定性好。

图3 国内不同橙汁产区浓缩还原商品橙汁饮料样品(样品1～11)图谱Fig.3 The spectrometry of samples from different regions in China

图4 阳性样品的图谱Fig.4 The spectrometry of positive samples

2.4 阳性样品的图谱

阳性样品的图谱如图4所示，图4中“a”、“b”、“c”、“d”分别为编号为“12”的阳性样品(样品信息见表1)、西瓜鲜榨汁、葡萄鲜榨汁、橘子鲜榨汁的图谱。

由图4中的“a”可得不含橙汁的的样品，没有橙汁蛋白质的特征谱图;由图“b”，“c”，“d”，可得橙汁蛋白质的指纹图谱与其他果汁指纹图谱不同，具有特征性。因此该方法可有效快速的检测不含橙汁或橙汁含量很低的勾兑饮料，及以其他果汁(如橘汁、葡萄汁等)冒充橙汁的掺假行为。

3 小结

本研究采用凝胶过滤色谱分离柱后复合考马斯亮蓝染色法，建立了橙汁中蛋白质按分子质量分布的的特征指纹图谱，并对橙汁掺假鉴别进行了初探。凝胶过滤色谱的分子筛作用可将不同分子质量的物质依次分离，避免了常见的小分子添加物，如糖类(葡萄糖、蔗糖、果糖)、有机酸(柠檬酸、苹果酸)的干扰;复合考马斯亮蓝染色剂的特异性避免了酚类物质及游离氨基酸等物质的干扰，方法简单、快速，抗干扰能力强，可用于检测不含橙汁的勾兑果汁，以及用其他果汁(如橘汁、葡萄汁等)冒充橙汁的掺假行为。但是由于目前收集的果汁样品数量有限，仍需扩大样品检测范围，对方法进行进一步验证。

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