机械预处理对酶解啤酒糟提取阿魏酰低聚糖的影响*

张秋培，尤梦竹，蔡国林1，，曹钰

1(江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)

2(江南大学生物工程学院，江苏无锡，214122)

3(江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏无锡，214122)

4(江南大学糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡，214122)

啤酒糟(brewer's spent grain，BSG)是啤酒生产中最大宗的副产物，干啤酒糟总蛋白含量约14%，总脂肪约13%，纤维素约11.5%，木质素约11.9%，半纤维素约40%，还含有少量的淀粉(2.9%)和灰分(3.2%)［1-2］，是良好的蛋白质源和膳食纤维源。目前啤酒糟的主要用途是作为反刍动物饲料，利用率低，浪费严重;个别厂家还将湿啤酒糟直接排放，对环境造成严重影响。因此，利用恰当的方法挖掘啤酒糟的高值化利用价值，提高经济效益和社会效益，变废为宝，成为国内外研究者普遍关注的热点。如提取啤酒糟中的蛋白质和阿拉伯木聚糖作为食物成分［3］;采用阿魏酸酯酶从啤酒糟中提取酚酸［1］;利用啤酒糟配以一定比例的玉米粉，通过双菌种制曲来生产营养食醋［4］;添加其他辅料，通过固态发酵来生产饲用木聚糖酶［5］等。

在植物细胞壁中，阿魏酸很少以游离态存在，而是与细胞壁中的多糖、低聚糖、多胺、酯类和木质素交联构成细胞壁的一部分［6-7］，用适度的酸或多糖水解酶水解啤酒糟细胞壁多糖，可得到不同聚合度的功能性阿魏酰低聚糖(feruloyl oligosaccharides，FOs)。FOs是阿魏酸与低聚糖通过酯键结合在一起形成的化合物，兼具阿魏酸和低聚糖的生理功能，如能调节人体的生理机能，具有抗血栓、抗动脉粥样硬化、降血脂、抑菌、消炎等功能［8］，同时能促进钙的吸收，调节胃肠道功能等［9］，由于其含有特殊的酯键，有些生理功能还有所增强［10］。目前提取FOs的方法有物理法、化学法和生物法［11］，较为常用的是酸法和生物酶法，如葛丽花分别采用草酸和三氟乙酸水解小麦麸皮制得了 FOs［12］;袁小平［13］、葛丽花［12］、姚惠源［14］均用木聚糖酶水解小麦麸皮制得了不同聚合度的FOs，Sorensen等［15］运用β-木糖苷酶和真菌半纤维素酶的混合物水解水不溶性小麦阿拉伯木聚糖，从而释放出FOs，Katapodis等［16］将玉米穗轴经超声波或高温蒸煮处理后，用来自热子囊菌的10-β-D-内切木聚糖酶水解，从而获得FOs，Katapodis等也将木聚糖内切酶作用于小麦面粉来提取FOs［17］。但是，啤酒糟作为富含粗纤维的丰富原料，目前还未见有从啤酒糟中提取FOs的研究。

本文旨在通过对啤酒糟进行不同预处理，进而比较预处理后啤酒糟中与FOs相关的一些物质的含量，从而选择一种相对有利于提取FOs的处理方式，将啤酒糟开发成具有高附加值的产品，改善生态环境，提高经济效益和社会效益。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

啤酒糟由青岛啤酒上海松江有限公司提供。

1.1.2 试验中所用主要试剂

木聚糖酶、纤维素酶均购买于帝斯曼(中国)有限公司，酶的活性如表1所示。NaOH、乙酸乙酯、MOPS、FeCl3、浓 HCl、无水乙醇、葡萄糖、木糖等，均为国产分析纯。

1.1.3 仪器与设备

Q-150A3刀片粉碎机，上海冰都电器有限公司;球磨机，长沙天创粉末技术有限公司;H1850R台式高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司;PL2002/EL204电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司;UV-2100紫外可见分光光度计，尤尼科(上海)仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅，江苏金坛荣华仪器制造有限公司;FE20实验室pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司;MICROTRAC S3500激光粒度分析仪，美国Microtrac;IKA RV10旋转蒸发仪，上海楚柏实验室设备有限公司。

1.2 啤酒糟的预处理

将湿啤酒糟(含水量60%)经过60℃干燥成为啤酒糟原样。机械预处理方式为刀片粉碎和刀片粉碎后球磨，将适量样品刀片粉碎3 min，刀片粉碎后的啤酒糟再分别球磨15 min和30 min。

1.3 粒径分布

MICROTRAC激光粒度分析仪测定不同方式处理的样品的粒径分布。

1.4 电镜扫描

对不同方式处理过的啤酒糟进行电子显微镜扫描(scanning electron microscope，SEM)加速电压50 kV，放大倍数2 000×，通过电镜扫描图观察不同机械预处理方式下啤酒糟原料表面形态的变化。

1.5 不加酶提取FOs

准确称取样品0.35 g，加入MOPS缓冲液(100 mmol/L，pH 5.0)5 mL，使底物质量浓度为70 g/L，50℃水浴反应6 h，于100℃加热10 min，4 500 r/min离心10 min，取上清液，用 MOPS缓冲液(100 mmol/L，pH 5.0)稀释，测定FOs的含量。

1.6 酶解制备FOs

木聚糖酶酶解实验:准确称取样品0.35 g，加入酶液5 mL，使底物质量浓度为70 g/L，加木聚糖酶(BAKEZYME HSP 6000 BG)酶量为100 U/g底物，50℃水浴反应6 h，100℃灭酶10 min，4 500 r/min离心10 min，取上清液，用 MOPS缓冲液(100 mmol/L，pH 5.0)稀释，测定FOs的含量。

纤维素酶酶解实验:纤维素酶酶量为1.36 U/g底物，其他条件与木聚糖酶酶解实验条件相同，检测酶解液中FOs的含量。

1.7 协同酶解制备FOs

准确称取样品0.35 g，加入酶液5 mL，使底物质量浓度为70 g/L，加木聚糖酶(BAKEZYME HSP 6000 BG)酶量为100 U木聚糖酶活力/g底物，加纤维素酶酶量为1.36 U纤维素酶活力/g底物，50℃水浴反应6 h，然后于100℃灭酶10 min，4 500 r/min离心10 min，取上清液，用 MOPS 缓冲液(100 mmol/L，pH 5.0)稀释，测定FOs的含量。

1.8 FOs的测定

采用双波长法测定样品中的FOs，以MOPS缓冲液(100 mmol/L，pH 5.0)为对照，在286 nm和325 nm处测定稀释到一定倍数的酶解液中的FOs的含量［18］。

已知对于阿魏酸:ε286nm=14 176，ε325nm=103 501

对于 FOs:ε286nm=12 465，ε325nm=19 345

列方程组:A286nm=14 176bC1+12 465bC2

A325nm=103 501bC1+19 345bC2

式中:ε表示摩尔吸光系数;A286nm表示被测液在286 nm处的吸光值;A325nm表示被测液在325 nm处的吸光值;b表示比色皿的厚度;C1表示阿魏酸的浓度，mol/L;C2表示 FOs的浓度，mol/L。

1.9 FOs的提取率计算

参考Szwajgier所采用的碱提法检测啤酒糟中的阿魏酸的含量［19］，假设阿魏酸全部以结合态存在，则FOs的得率为:

式中:Q表示单位质量啤酒糟中提取到的FOs的量，μmol/g(啤酒糟);m表示单位质量啤酒糟中阿魏酸的含量，μg/g(啤酒糟);194.19指阿魏酸的摩尔质量。

1.10 数学分析方法

采用excel 2003进行单因素方差分析，探究数据间的差异显著性。

2 结果与讨论

2.1 机械预处理对啤酒糟粒径分布的影响

经60℃干燥的啤酒糟原料，呈梭形、长8～12 mm、直径3～4 mm，啤酒糟机械预处理后的粒径分布如图1所示。

由图1可知，经过机械处理后啤酒糟颗粒明显变小，刀片粉碎的样品主要粒径分布集中在100～700 μm，而刀片粉碎后经过不同时间球磨的啤酒糟的粒径都有一定程度的变小，其中，球磨15 min的啤酒糟原料主要粒径分布集中在10～350 μm，55.67%的粒径小于100 μm，球磨30 min的啤酒糟原料主要粒径分布集中在10～200 μm，76.78%的粒径小于100 μm。由于颗粒越小，越容易聚集在一起，因此粉碎得越细的的啤酒糟的粒径大小的值可能比实际值偏大。啤酒糟经刀片或球磨处理后，其颗粒减小，理论上酶解时其接触的有效表面积增大，在一定程度上可以促进酶水解，更有利于FOs的提取。

2.2 机械预处理对啤酒糟表面形态的影响

啤酒糟经不同方法处理后进行电镜扫描，不同预处理后啤酒糟表面形态结构的变化如图2所示，各图视野放大倍数均为2 000×。从图2中可以清楚看出，啤酒糟经不同机械处理后，原有的结构完全被破坏，块状结构逐步碎裂成细小颗粒，粗糙程度变大，其中刀片粉碎后球磨30 min的啤酒糟基本无大的块状颗粒存在，且粉碎度均匀。与2.1中不同预处理的啤酒糟的粒径分布相符。啤酒糟中皮壳本身的紧密结构是导致酶解效率低的原因之一，啤酒糟经机械预处理后紧密度降低，粒径变小，反应面积增大，将有利于酶解反应的进行。

2.3 机械预处理对啤酒糟中原有FOs的影响

啤酒糟经不同预处理后其可提取到的FOs的含量如图3所示，刀片粉碎啤酒糟与原样中可提取的FOs的量相当，差异不显著(P＞0.05)，而刀片粉碎后球磨15 min和刀片粉碎后球磨30 min的样品中可提取的FOs的含量比原样提高了6.3%和14.4%，差异显著(P＜0.05)。碱提法检测啤酒糟中阿魏酸的含量为4469.4 μg/g啤酒糟，则啤酒糟原样和刀片粉碎后球磨30 min的啤酒糟中 FOs的得率分别为12.34%和14.12%。

FOs是阿魏酸与低聚糖通过酯键结合在一起形成的化合物，其中低聚糖主要指低聚木糖，Niemi等［20］研究粉碎预处理对啤酒糟中糖类的酶水解的影响发现，经研磨预处理后，水溶性阿拉伯木聚糖含量由32%提高到了46%，水溶性纤维素的含量由13%提高到了45%，即与木聚糖相比，粉碎预处理对纤维素的降解的影响更大。机械预处理虽然可以部分打破细胞壁结构，提高阿拉伯木聚糖和纤维素的溶解性，但并不能撕裂或断裂大分子多糖的分子结构，因此粉碎处理并不能大幅度提高FOs的含量。

2.4 机械预处理对木聚糖酶酶解啤酒糟提取FOs的影响

啤酒糟经不同方式预处理后，在相同条件下进行木聚糖酶水解，其结果如图4所示，经过不同预处理的样品加木聚糖酶后，可提取的FOs的量是未酶解的样品的2～3倍，且不同预处理间提取到的FOs的量差异显著(P＜0.05)。

可见，随着啤酒糟粒径的减小和粉碎程度的增加，所提取到的FOs的含量也随之增加，其中，经木聚糖酶水解后，啤酒糟原样中提取到的FOs的含量为7.34 μmol/g底物，得率为31.89%，刀片粉碎后球磨30 min的样品中提取到的 FOs的含量为9.09 μmol/g底物，得率为39.49%，比原样酶解提高了23.83%。机械预处理可以部分打破细胞壁结构，增加木聚糖和纤维素的溶解性，在木聚糖酶的作用下，木聚糖的分子结构被破坏，并进一步被水解成中小分子，从而促进木聚糖酶的酶解效率，进而提高FOs的提取效率。

2.5 机械预处理对纤维素酶酶解啤酒糟提取FOs的影响

啤酒糟经不同方式预处理后，在相同条件下进行纤维素酶水解，结果如图5所示，啤酒糟经预处理后提取到的FOs的含量是相应未加酶样品的34倍，酶解效果优于商品木聚糖酶的酶解效果，且不同预处理间提取到到的FOs的量差异极显著(P＜0.01)。

不同处理方式处理的啤酒糟，经商品纤维素酶酶解后，提取到的FOs的含量的变化趋势与商品木聚糖酶酶解时的变化趋势一致，即随着粉碎程度的增加，所提取到的FOs的含量也增加。其中，啤酒糟原样中提取到的FOs的含量为7.69 μmol/g底物，得率为33.41%，刀片粉碎后球磨30 min的样品中提取到的FOs的含量为 11.59 μmol/g底物，得率为 50.36%，比原样提高了50.73%。机械预处理降低样品的致密度和粒径大小，纤维素酶、β-葡聚糖酶的作用进一步破坏纤维素-半纤维素-木质素的网络结构，使半纤维素结构暴露出来，木聚糖酶能够更容易的作用于底物，从而更有利于提取到FOs。

2.6 机械预处理对木聚糖酶纤维素酶协同作用提取FOs的影响

啤酒糟经不同方式预处理后，同时添加商品木聚糖酶和纤维素酶进行酶解，其酶解结果如图6所示。酶解后提取到的FOs的量是未酶解的相应样品的4～5倍，同样，随着粉碎程度的增加，啤酒糟样品中FOs的提取量也增加，且不同预处理间FOs的提取量差异极显著(P＜0.01)，其中啤酒糟原样中为10.82 μmol/g底物，得率为47.01%，刀片粉碎后球磨30 min的样品中为 14.73 μmol/g底物，得率为64.00%，比原样提高了36.14%。

在前期研究木聚糖酶的最佳添加量时发现，加酶量为40 U/g底物时最佳，再增加加酶量，FOs的提取率趋于稳定，结合图4、图5和图6的结果，刀片粉碎后球磨30 min的样品同时添加纤维素酶和木聚糖酶，FOs的得率由39.49%(木聚糖酶)和50.36%(纤维素酶)，提高到了64.00%，可知，在纤维素酶活力和β-葡聚糖酶活力作用于纤维素后，暴露出半纤维素，可以促进木聚糖酶进一步水解木聚糖，从而使FOs的得率有所增加。

3 结论

啤酒糟经刀片粉碎和球磨后其颗粒直径显著变小，从电镜扫描结果看，增加啤酒糟的球磨时间，颗粒变得更细，同时，对啤酒糟进行预处理，可以提高纤维素的溶解度，从而更有利于制备FOs的关键酶作用于底物木聚糖，如，啤酒糟未酶解前，经不同预处理的样品中提取到的FOs的量相当，经不同酶水解后，可提取到的FOs的量提高了2～5倍。刀片粉碎后球磨30 min的啤酒糟，经商品木聚糖酶和纤维素酶水解后，FOs的得率分别为39.49%和50.36%，经商品木聚糖酶和纤维素酶协同作用后，FOs的得率为64.00%，商品木聚糖酶、纤维素酶协同酶解效果明显。机械预处理可以在一定程度上提高酶解效率，纤维素酶、β-葡聚糖酶破坏纤维素有利于木聚糖酶的水解作用，综上，机械预处理和酶的协同作用能够提高FOs的得率，从而为实现啤酒糟的高值化利用奠定了基础。

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