102例急性白血病的细胞形态学、免疫学及分子生物学分型

唐艳萍，张力图，蔡政民，唐亚梅，苏程琳，谭晓玉，谢雨萱，利基林(广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021)



102例急性白血病的细胞形态学、免疫学及分子生物学分型

唐艳萍，张力图，蔡政民，唐亚梅，苏程琳，谭晓玉，谢雨萱，利基林(广西医科大学附属肿瘤医院，南宁 530021)

摘要：目的观察102例急性白血病的细胞形态学、免疫学及分子生物学分型结果。方法采用细胞形态学分型、流式细胞学免疫分型、多重巢式RT-PCR检测白血病融合基因三项技术对102例急性白血病患者进行综合诊断分析。结果102例白血病患者按FAB分型诊断为ALL 51例，AML 45例，难分类白血病(UAL)6例。FAB分型无法确诊的6例UAL患者经流式免疫分型后诊断为2例B-ALL、3例B /T细胞系白血病和1例急性混合型白血病(髓系/B细胞系)，其余96例患者与流式分型结果一致，诊断为B-ALL 36例，T-ALL 15例，AML 45例。102例急性白血病患者中检出融合基因36例(35.3%)，包括PML/RARα、CBFβ/MYH11、AML1/ETO、TLS/ERG、TEL/AML1、E2A/PBX1、MLL/AF9、MLL/AF4、BCR/ABL 9种融合基因。结论FAB分型对UAL无法确诊时，与细胞免疫学及分子生物学分型联合，可使白血病分型更为精确、客观。

关键词：急性白血病；形态学分型；免疫学分型；融合基因

传统细胞形态学检查是诊断白血病的基础，诊断标准简便，然而光镜下形态学观察和细胞化学方法对细胞识别力有限，对于未分化型白血病及一些形态学不典型的白血病，难以准确分型，其诊断有一定的局限性[1]。目前，WHO要求白血病的诊断标准是细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子学生物学的实验室诊断、临床症状、体征的联合诊断法。本研究以102例急性白血病患者为对象，以形态学、免疫学、分子学生物学特征相结合的方式，采用细胞形态学分型、流式细胞学免疫分型、多重巢式检测RT-PCR白血病融合基因三项技术进行综合判断，以使白血病的诊断分型更加科学化和规范化。

1资料与方法

1.1临床资料广西医科大学附属肿瘤医院2011年8月～2013年12月收诊的102例急性白血病初治患者。男72例、女30例，年龄2～80岁。患者均经骨髓细胞形态学检查确诊，符合WHO的FAB诊断标准。ALL 51例，AML 45例，难分类白血病(UAL)6例。

1.2主要仪器及试剂Beckman-Coulter Epics XL流式细胞仪(Beckman-Coulter公司)；TProfessional热循环仪(biometra公司)；UVI FireReader 凝胶成像系统(UVITEC公司)；MK-20干式恒温仪(杭州奥盛)。单克隆抗体：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人单克隆抗体CD20、sIgM、cIgM、CD5、CD7、TdT、HLA-DR、CD13、 MPO；藻红蛋白荧光素 (PE)标记的鼠抗人单克隆抗体CD2、CD10、CD22、CD33、CD117、cCD79a；藻红蛋白—得克萨斯红(ECD)标记的鼠抗人单克隆抗体CD3、CD14、CD19、CD34、cCD3；藻红蛋白—花青素(PE-Cy5)标记的鼠抗人单克隆抗体CD45；溶血剂、破膜剂、固定剂、鞘液(PBS)均购自Beckman-Coulter公司。

1.3方法

1.3.1标本处理严格按无菌操作规程，取患者骨髓，每管2～3 mL，EDTA抗凝，混匀，分别行细胞形态学检查、流式细胞学免疫分型及融合基因检测。

1.3.2细胞形态学检查患者骨髓涂片，行免疫组化染色分析白血病的分型(FAB分型)。

1.3.3流式细胞学免疫分型采用四色荧光素(FITC、PE、PC5、ECD)标记法进行骨髓血细胞免疫表型分析。细胞膜抗体标记：取15 μL样品与单抗5 μL混匀后室温避光孵育15 min，加入600 μL溶血剂混匀避光孵育15 min，鞘液洗涤2次，100 μL鞘液重悬即可上机检测。胞质内抗体标记：取15 μL样品与5 μL CD45混匀后室温避光孵育15 min，加固定剂避光孵育15 min后鞘液洗涤，加40 μL破膜剂避光孵育15 min，加入待测抗体各5 μL，鞘液洗涤2次，100 μL鞘液重悬即可上机检测。结果判定以膜抗原≥20%，胞质内抗原≥10%为阳性。

1.3.4多重巢式RT-PCR检测 ①细胞总RNA提取：分离患者骨髓的单个核细胞，采用血液总RNA提取试剂盒(天根，货号：DP433)提取总RNA，并通过微量紫外分光光度仪测定RNA浓度及纯度。②逆转录反应：反应体系20 μL， 含Oligo dT18 Primer、逆转录缓冲液、dNTP、RNasin、MMLV 逆转录酶。42 ℃、1 h, 70 ℃、5 min逆转录反应合成cDNA。③PCR扩增：采用融合基因筛查试剂盒(北京思尔成公司，货号：F103)进行多重巢式PCR。第1轮扩增条件：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，59 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共25个循环；72 ℃、8 min。第2轮扩增条件：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，59 ℃、1 min，72 ℃、1 min，共29个循环；72 ℃、8 min。④PCR 产物电泳：取第2轮PCR产物，在2%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照。

2结果

2.1FAB分型102例白血病患者按FAB分型诊断为ALL 51例，其中L17例，L237例，L37例；AML 45例，其中M11例，M214例，M310例，M46例，M514例；UAL 6例。

2.2白血病流式细胞学免疫分型102例白血病中根据免疫分型诊断为B-ALL共38例，T-ALL共15例，AML共45例。6例FAB无法确诊的UAL经流式免疫分型后诊断为ALL(B /T细胞系)3例，其中急性混合型白血病(髓系/B细胞系)1例，B-ALL 2例；其余96例患者与流式分型结果一致，诊断为B-ALL 36例，T-ALL 15例，AML 45例。38例B-ALL主要表达抗原依次为cCD79a(89.5%，34/38)、CD19(86.8%，33/38)、CD10(78.9%，30/38)、CD22(76.3%，29/38)，非特异性早期标志抗原HLA-DR(73.7%，28/38)表达率较高。B-ALL交叉表达 CD33有10例(26.3%，10/38)，CD2有2例(5.3%，2/38)，CD5有2例(5.3%，2/38)。15例T-ALL患者最敏感的指标为cCD3(80.0%，12/15)、CD7(80.0%，12/15)，其次为CD2(73.3%，11/15)、CD5(66.7%，10/15)。T-ALL有4例 CD10(26.7%，4/15)、2例CD33(13.3%，2/15)交叉表达。45例AML患者中，以CD33、cMPO、CD117表达高，分别为97.8%(44/45)、84.4%(38/45)、73.3%(33/45)。AML中交叉表达 CD7有3例(6.7%，3/45 )、CD19有3例(6.7%，3/45)。

2.3多重巢式RT-PCR检测白血病相关融合基因102例急性白血病患者检出融合基因36例，总检出率为35.3%。在56例急性淋巴细胞白血病患者中检出融合基因21例，总检出率为37.5%，包括TLS/ERG、TEL/AML1、E2A/PBX1、MLL/AF9、MLL/AF4、BCR/ABL6种融合基因，分别为3、6、4、2、1、5例，各占14.3%、28.6%、19.0%、9.5%、4.8%、23.8%。 8例ALL-L3未检出融合基因。在45例急性髓细胞白血病患者中, 检出融合基因14例，总检出率为31.1%，包括PML/RARα、CBFβ/MYH11、AML1/ETO、MLL/AF9 4种融合基因，分别为7、4、1、2例，各占50.0%、28.6%、7.1%、14.3%。此外，1例急性混合型白血病检出TLS/ERG融合基因。

3讨论

白血病是造血组织的原发恶性疾病，具有生物学的异质性、分化程度的差异性和细胞形态的多形性等特点，其诊断需进行明确分型[2]。伴随科学技术的不断发展，白血病的分型得到不断完善，从最初的FAB分型，到最新的MICM分型。本研究对102例急性白血病进行FAB分型、免疫分型及分子生物学特性的联合分析。按FAB分型诊断ALL 51例，AML 45例，UAL 6例。传统FAB分型诊断的ALL和AML与免疫分型基本一致，6例UAL根据流式免疫分型可以明确诊断为2例B-ALL、3例ALL(B /T细胞系)、1例急性混合型白血病(髓系/B细胞系)。因此，根据免疫分型诊断ALL 56例，其中B-ALL共38例，T-ALL 15例，B /T细胞系3例；AML45例；髓系/B细胞系1例。

CD13、CD33具有骨髓相对特异性；MPO为中性粒细胞内嗜苯胺蓝颗粒的主要成分，其蛋白于早幼粒阶段开始合成，MPO是髓系特异性标志[3]。有研究[4]表明CD117是髓系较特异的表面标志，可作为辅助诊断AML的标志抗原。本研究发现，AML患者M1～M5各亚型广泛表达CD33(97.8%)、CD117(73.3%)和胞质内抗原cMPO(84.4% )，但特异性有所差异。CD33在B-ALL、T-ALL中有交叉表达，表达率为26.3%、13.3% 。而 CD117(5.3%、6.7%)和 cMPO(5.3%，0% )交叉表达少见，特异性较好。在较多文献[5，6]中还报道了AML患者高表达CD13，但在本次研究中CD13的表达率仅为31.1%，并且6例M4无1例表达。

B淋巴系最常见的抗原有cCD79、CD19、CD10、CD20、CD22。cCD79a是B淋巴系的特异性标志，只表达与胞质内，不表达于细胞膜。有文献[7]报道CD10对预后判断具有提示作用，通常CD10阳性B-ALL患者预后较好。本研究中cCD79a在B-ALL中高表达(89.5%)，在AML中偶有表达(4.4%)，在T-ALL中无表达。CD19(86.8%、CD10(78.9%)、CD22(76.3%)在 B-ALL中常见表达，CD20敏感性较差，表达率只有36.8%。cCD3抗原是T淋巴细胞的特异性标志，其在胞质内的出现早于细胞膜，因此检测胞质内敏感性强于胞膜。T-ALL中cCD3(80.0%)、CD7(80%)、CD2(73.3%)和CD5(66.7%)的敏感性及特异性均较高，在AML和B-ALL中表达极低。

多数白血病遗传学异常与形态学的关系尚无明确关系，但已发现某些融合基因在FAB分型中具有特定的分布特点[8]。PML/RARα融合基因由t(15;17)(q22；q21)染色体异位形成，主要见于AML-M3。本研究所检出的7例均出现于M3患者。CBFβ/MYH11融合基因由inv(16)(p13；q22)及t(16；16)(p13；q22)染色体异位形成，主要见于M4，也见于部分M5，少数见于M2。检出的4例CBFβ/MYH11融合基因出现于3例M4和1例M2患者。TEL/AML1融合基因是儿童急性淋巴细胞白血病中最常见的染色体结构异常，常见于25%的儿童B-ALL患者，患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预后好。本研究检出的6例阳性表达患者均为儿童，年龄4～15岁，免疫分型显示均为B-ALL。E2A/PBX融合基因主要见于3%～5%儿童和3%的成人ALL患者，约占儿童前驱B细胞ALL患者的25%。本研究检测出的4例阳性表达患者均为儿童前驱B细胞ALL患者。检出的5例BCR/ABL阳性患者经免疫分型分析为B-ALL患者，与报道[9]相一致。此外，TLS-ERG与MLL/AF9两种融合基因在ALL和AML患者中均出现。

本研究以FAB分型为基础，应用流式细胞术的免疫分型，采用单克隆抗体对白血病的细胞来源和分化阶段进行更精细的检测，从而提高了白血病诊断的准确率，弥补了FAB分型的不足。再联合分子生物学检测，以其灵敏、快速、准确的特点，使白血病分型更为精确、客观，为临床诊断、预后及治疗方案的选择提供更为可靠的依据。

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(收稿日期：2014-08-29)

通信作者：利基林

基金项目：广西科学研究与技术开发计划项目(1298003-2-8)。

中图分类号：R733.71

文献标志码：B

文章编号：1002-266X(2015)03-0038-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.03.014