VASH1和VEGFR-2在宫颈鳞癌组织的表达及意义

王玉霞，孔红霞，韩贝贝，陈雁南，刘燕(郑州大学第三附属医院，郑州450052)

VASH1和VEGFR-2在宫颈鳞癌组织的表达及意义

王玉霞，孔红霞，韩贝贝，陈雁南，刘燕
(郑州大学第三附属医院，郑州450052)

摘要:目的探讨血管生成抑制蛋白1(VASH1)和血管内皮细胞生长因子受体-2(VEGFR-2)在宫颈鳞癌组织中的表达及意义。方法选取20例正常宫颈组织、25例宫颈上皮内瘤变(CIN)组织、45例宫颈鳞癌组织，采用免疫组化SP法和荧光定量PCR法分别检测VASH1和VEGFR-2的表达。结果宫颈鳞癌组织中VASH1、VEGFR-2蛋白阳性表达率均高于CIN组织、正常宫颈组织(P均＜0.05)。VASH1 mRNA、VEGFR-2 mRNA在宫颈鳞癌组织中的相对表达量均高于CIN组织及正常宫颈组织(P均＜0.05)。VASH1的表达与宫颈鳞癌淋巴结转移、临床分期有关(P均＜0.05)，VEGFR-2的表达与宫颈鳞癌淋巴结转移、临床分期及组织病理学分级有关(P均＜0.05)。宫颈鳞癌组织中VASH1与VEGFR-2的表达呈正相关(r=0.617，P＜0.01)。结论宫颈鳞癌组织中VASH1、VEGFR-2高表达，二者的表达变化可能与宫颈鳞癌的发生发展有关。

关键词:宫颈肿瘤;肿瘤，鳞状细胞;血管生成抑制蛋白;血管内皮细胞生长因子受体

新生血管在肿瘤的生长、侵袭和转移过程中发挥着关键作用，为肿瘤供应所需营养，并为肿瘤的转移提供了通道［1］。因此，抗肿瘤血管生成成为研究肿瘤治疗方法的一个重要方向。血管生成抑制蛋白1(VASH1)是近年来新发现的一种以负反馈调节为主的血管生成抑制蛋白，主要来源于血管内皮细胞。VASH1主要由血管内皮细胞生长因子(VEGF)诱导，VEGF与其受体VEGFR-2结合后启动下游PKC-δ信号通路，进而促进内皮细胞VASH1的表达。VASH1对肿瘤血管新生发挥着至关重要的负反馈调节作用，主要抑制新生血管的发芽时期，可在体内外明显抑制肿瘤的发展［2］。本研究观察了VASH1 和VEGFR-2在宫颈鳞癌组织中的表达变化，并探讨二者在宫颈鳞癌发生发展中的作用。现报告如下。

1　资料与方法

1.1临床资料收集2013年9月～2014年11月本院手术切除宫颈组织标本90例，经病理学检查证实正常宫颈组织20例(患者年龄32～67岁、平均45.6岁)、宫颈上皮内瘤变(CIN)组织25例(患者年龄30～64岁、平均42.2岁)、宫颈鳞癌组织45例(患者年龄30～70岁、平均46.1岁)。三类患者年龄比较差异无统计学意义，术前均无放疗、化疗及免疫治疗史。

1.2宫颈组织中VASH1、VEGFR-2蛋白表达检测宫颈组织切除后一部分甲醛固定、石蜡包埋、4 μm厚度常规切片，另一部分快速置于液氮中－80℃保存。采用免疫组化SP法，取切片严格遵循试剂盒说明书采用二步反应法进行染色，以PBS代替一抗作阴性对照。每张切片至少观察5个高倍镜下视野，镜下细胞质和(或)细胞膜显示棕黄色或棕褐色判定细胞阳性。细胞染色无色计0分，轻度着色1分，中度着色2分，重度着色3分;阳性细胞百分比＞50%计3分，26% ～50%计2分，5%～25%计1分，＜5%计0分;两种评分乘积＞3为阳性，≤3为阴性。

1.3宫颈组织中VASH1 mRNA、VEGFR-2 mRNA表达检测采用荧光定量PCR技术。按照RNA提取试剂盒说明书提取宫颈组织总RNA，用紫外分光光度计测RNA浓度及纯度，遵照逆转录试剂盒说明书逆转录合成cDNA。VASH1上游引物5'-GAACTACTTCCGCCACATCG-3'，下游引物5'-CCAGCTTCACCTTCTTGAGC-3'; VEGFR-2上游引物5'-TTACTTGCAGGGGACAGAGG-3'，下游引物5'-TTCCCGGTAGAAGCAC TTGT-3'; GAPDH(内参)上游引物5'-AGAAGGCTGGGG CTCATTTG-3'，下游引物5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。PCR反应体系: 2 ×UItraSYBR Mixture 10 μL，上游、下游引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，RNase-Free Water 7.4 μL总反应体系为20 μL。PCR反应程序: 95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火/延伸1 min，共40个循环。溶解曲线分析: 95℃、15 s，60℃、1 min，95℃、15 s，60℃、15 s。采用ABI7500荧光定量PCR仪，Ct值代表每个反应体系内的荧光信号到达设定的阈值所需的循环数，Ct值与目的基因表达水平呈负相关。用2－ΔΔCt相对定量法分析目的基因(VASH1、VEGFR-2)的表达情况［3］，ΔCt=目的基因Ct－内参基因Ct，ΔΔCt=目的基因ΔCt－标准值ΔCt，目的基因的相对表达量即为2－ΔΔCt。

1.4统计学方法采用SPSS17.0软件统计。阳性表达率以百分比表示，2ΔΔCt以相对比［M(95% CI)］表示，组间比较采用秩和检验。采用Spearman相关分析VASH1与VEGFR-2表达的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1三种宫颈组织VASH1、VEGFR-2蛋白表达比较VASH1蛋白在正常宫颈组织、CIN组织及宫颈鳞癌组织中阳性表达率分别为15.0% (3/20)、44.0% (11/25)及75.6%(34/45)，VEGFR-2分别为10.0% (2/20)、40.0%(10/25)、66.7%(30/45) ;宫颈鳞癌组织中VASH1、VEGFR-2蛋白阳性表达率均高于CIN组织、正常宫颈组织(P均＜0.05)。

2.2三种宫颈组织VASH1 mRNA、VEGFR-2 mRNA的表达比较VASH1和VEGFR-2 mRNA在宫颈鳞癌组织中的相对表达量均显著高于CIN组织及正常宫颈组织(P均＜0.05)。见表1。

2.3VASH1 mRNA和VEGFR-2 mRNA表达与宫颈鳞癌临床病理参数的关系VASH1 mRNA表达与宫颈鳞癌淋巴结转移、临床分期有关(P均＜0.05)，与年龄、组织病理学分级无关(P均＞0.05) ; VEGFR-2 mRNA表达与宫颈鳞癌淋巴结转移、临床分期及组织病理学分级有关(P均＜0.05)，而与年龄无关(P＞0.05)。见表2。

2.4VASH1mRNA与VEGFR-2mRNA表达的相关

3　讨论

VASH1基因定位于染色体14q24.3，包含7个内含子及8个外显子，由365个氨基酸残基构成［4］。Ito等［5］研究发现接种过Lewis肺癌细胞的小鼠中，缺乏VASH1基因的小鼠肺部和腹股沟淋巴结转移量明显升高，表明VASH1有一定的抗肿瘤淋巴结转移作用。Zhang等［6］研究结果显示非小细胞肺癌组织中VASH1阳性表达率为63.1%，高于癌旁组织(21.4%)，且随肿瘤临床分期的增高、淋巴结的转移，VASH1的阳性表达率升高。Yoshinaga等［7］研究结果显示VASH1在宫颈鳞癌和腺癌组织中的表达水平显著高于正常宫颈组织，认为VASH1在宫颈癌的发生发展中可能对新生血管有抑制作用。另有研究发现，VASH1在胃癌［8］、前列腺癌［9］、子宫内膜癌［10］、食管癌［11］等恶性肿瘤中高表达。本研究采用免疫组化染色法及荧光定量PCR技术检测VASH1在不同宫颈组织中的表达水平，结果显示宫颈鳞癌组织中VASH1蛋白阳性表达率、VASH1 mRNA相对表达量均高于CIN组织、正常宫颈组织(P均＜0.05)。且VASH1的表达与宫颈鳞癌临床分期、淋巴结转移有关，这与Yoshinaga等［7］的研究结果相符，提示VASH1可能在宫颈鳞癌发生发展过程中抑制了新生血管生成。

VEGFR-2是VEGF的主要功能受体，其与VEGF结合后，主要在生理病理情况下介导新生血管的形成［12］。VEGFR-2基因位于人染色体4q 31.2-32，由7个Ig结构域组成的胞外区、1个跨膜结构区及胞质内酪氨酸激酶结构区构成［13］。VEGF/VEGFR-2介导的信号通路可调控血管内皮细胞的增殖、迁移和通透性，进而促进血管生成［12］。丁曼华等［14］利用免疫组化法检测到非小细胞肺癌组织中VEGFR-2的阳性率为57.5%，显著高于肺部良性病变组织，差异有统计学意义;且VEGFR-2的表达水平与非小细胞肺癌临床分期、组织分化程度及淋巴结转移呈正相关。Kopparapu等［15］的研究结果显示VEGFR-2在171例膀胱癌组织中阳性表达率显著高于癌旁组织，认为VEGFR-2可能参与了膀胱癌的发生发展。众多研究［16，17］发现VEGFR-2在多种肿瘤如胃癌、结直肠癌、白血病、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌中过表达，提示VEGFR-2可能与多种恶性肿瘤的发生发展相关。本研究结果显示，宫颈鳞癌组织中VEGFR-2蛋白阳性表达率、VEGFR-2 mRNA相对表达量均高于CIN组织、正常宫颈组织，且VEGFR-2的表达与宫颈鳞癌临床分期、组织病理学分级及淋巴结转移有关，说明VEGFR-2的高表达可能与宫颈鳞癌的发生发展有关。

本研究中VASH1和VEGFR-2在宫颈鳞癌组织中均高表达，且二者呈正相关，提示VASH1、VEGFR-2与宫颈鳞癌的发生发展密切相关。VASH1可抑制肿瘤血管和淋巴管的新生，有望成为宫颈鳞癌及更多恶性肿瘤抗血管生成治疗的新靶点。

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(收稿日期:2014-12-21)

通信作者:孔红霞

文章编号:1002-266X(2015)21-0040-03

文献标志码:B

中图分类号:R587.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.21.015