羊芪通络胶囊质量标准的研究

张妍妍 李思佳

（黑龙江中医药大学·150040）

羊芪通络胶囊由淫羊藿、黄芪、麻黄、穿山龙、延胡索等药味组成。具有温经散寒，通络止痛之功效。用于寒湿闭阻经络所致的痹病，症见腰脊疼痛、四肢关节冷痛；风湿性关节炎见上述证候者。为控制制剂质量，对其进行质量标准的建立。

1 仪器与试药

Agilentl200高效液相色谱仪(安捷伦公司)。ELSD 2000ES蒸发光散射检测器(Alltech)。Diamonsil C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm）色谱柱。羊芪通络胶囊由黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室提供（批号：20140601、20140602、20140603；规格：每粒含胶囊内容物0.28g），盐酸麻黄碱（批号714-8501）、黄芪甲苷（批号0781-200109）、淫羊藿苷（批号0734-9508）、延胡索乙素（批号110726-200409）、薯蓣皂苷元（批号1539-200001）均购自中国药品生物制品检定所。甲醇、乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 淫羊藿薄层色谱鉴别[1]取本品胶囊内容物10g，加乙醇60ml，超声处理20分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取淫羊藿苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（2010年版《中国药典》一部附录VI B）试验，吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水（10:1:1.5:0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性样品无此斑点。

2.1.2 麻黄薄层色谱鉴别[2]取本品胶囊内容物6g，加浓氨试液数滴，再加三氯甲烷60ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-浓氨试液（20:5:0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点，而阴性样品无此斑点。

2.1.3 穿山龙薄层色谱鉴别[2]取本品胶囊内容物5g，加甲醇80ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加3mol/L盐酸溶液50ml使溶解，置水浴中加热水解30分钟，放冷，再加入三氯甲烷50ml，加热回流15分钟，滤过，取三氯甲烷液蒸干，残渣加三氯甲烷-甲醇（1:1）的混合溶液3ml使溶解，作为供试品溶液。另取薯蓣皂苷元对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（20:0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%磷钼酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性样品无此斑点。

2.1.4 延胡索薄层色谱鉴别[3]取本品胶囊内容物6g，加80%乙醇60ml，加热回流 1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，加浓氨试液调至ph值9～10，用乙醚振摇提取2次，每次20ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加乙醇5ml使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液各5～10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-氯仿-甲醇(7.5:4:1)为展开剂，展开，取出，晾干，以碘蒸气熏至斑点清晰，在空气中挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性样品无此斑点。

2.2 黄芪甲苷含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验[4]以十八烷基键合硅胶为填充剂；以乙腈-水（31:69）为流动相；蒸发光散射检测器参数：氮气流速为 2 L/min；漂移管温度为 90 ℃；增益为 1[5]。

2.2.2 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备[6]取本品胶囊内容物20g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇40ml，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4h，提取液回收溶剂并浓缩至干，残渣加水10ml，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40ml，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40ml，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5ml使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂（内径1.5cm，长12cm），以水50ml洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30ml洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 线性关系的考察 精密量取对照品溶液1、2、5、10、20μL，依次进样，进行测定，记录色谱峰面积，以黄芪甲苷进样量的自然对数值为横坐标（X），以峰面积自然对数值为纵坐标（Y），进行线性回归，计算回归方程为Y=2.0242X+6.9902，r=0.9997，结果表明黄芪甲苷在0.2～4μg范围内具有良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10μl，按上述色谱条件重复测定6次，记录峰面积，黄芪甲苷峰面积的RSD值为1.08%。

2.2.6 稳定性试验 取2.2.3项下的供试品溶液1份于0、2、4、6、8、12、20、24h，分别精密量取10μl进样，记录峰面积，结果黄芪甲苷的RSD值为1.15%。表明溶液的稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取本品胶囊内容物，平行制备6份供试品溶液分别按含量测定方法测定。结果黄芪甲苷平均含量为0.05mg/g，RSD=1.67%（n=6）。结果表明本方法重复性好。

2.2.8 加样回收率试验 精密吸取已知含量的样品（批号：20140602，含量为0.05mg/g）10g，加入上述对照品溶液2.5ml，精密加入甲醇40ml使溶解，依法制备同一批供试品溶液 6份，测定含量，计算回收率。经计算加样回收率为97.67%，RSD为2.39%，表明本方法测定结果准确可行。结果见表 1。

表1 黄芪甲苷加样回收实验结果（n=6）

2.2.9 样品测定 分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。三批样品（批号：20140601、20140602、20140603）按干燥品计算，黄芪甲苷的平均含量为不得少于0.05mg/g。

3 讨论

淫羊藿、黄芪为羊芪通络胶囊方中的君药，故在质量标准研究过程中建立淫羊藿、黄芪的定性、定量方法，以便更好的控制该药剂的质量。在本品质量标准研究过程中，也尝试对处方中的牛膝等药味进行定性鉴别，但由于处方中含量较低，或检测指标受热破坏等原因没有建立定性鉴别的方法。黄芪甲苷紫外末端只有弱吸收，采用 HPLC-ELSD 测定含量，灵敏度高，结果比较理想[7]。在建立黄芪甲苷含量测定方法的过程中，本实验首先考察乙腈-水（32:68）为流动相的分离效果，结果是黄芪甲苷峰处有一肩峰，后又通过调整流动相至乙腈-水（31:69），获得较好的分离效果，进而确定洗脱条件。

[1]马清娟,王晶,韩凌,吕重宁,贾凌云,路金才.HPLC法同时测定淫羊藿药材中8种黄酮类成分的含量[J].沈阳药科大学学报,2014,12:970-978.

[2]国家药典委员会．中华人民共和国药典:一部[S].2010 版.北京: 中国医药科技出版社，2010: 283-284.

[3]唐秀玲,韦家福,张林丽. 仙龙抗癌胶囊薄层色谱鉴别[J].广西医学,2002,11:1747-1748.

[4]冯琬淇,袁桂霞.HPLC-ELSD法测定阿胶三宝膏中黄芪甲苷的含量[J].中医药导报,2015,09:60-62.

[5]崔春利,王梅,郭东艳,唐志书.HPLC-ELSD测定芪黄颗粒中的黄芪甲苷[J].陕西中医,2013,02:236-237.

[6]刘浩文,刘嘉仪,杨妙荣,陈建萍,王冬梅.黄芪药材中黄芪甲苷含量测定的两种方法的比较研究[J].中药新药与临床药理,2011,06:659-662.

[7]丁如贤,李霞,李一珺,孙雪妹,杨明华.黄芪药材、饮片中黄芪甲苷含量测定方法的改进[J].世界中医药,2013,06:669-671.