保护剂在微生物真空冷冻干燥中的应用

牛晓影,邓丽莉,曾凯芳,2,*

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400715;2.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆),重庆 400715)

保护剂在微生物真空冷冻干燥中的应用

牛晓影1,邓丽莉1,曾凯芳1,2,*

(1.西南大学食品科学学院,重庆 400715;2.农业部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(重庆),重庆 400715)

真空冷冻干燥后微生物较低的存活率在一定程度上限制了诸如采后果蔬生防试剂、益生菌、发酵剂等的开发及应用,而保护剂的加入可以较大幅度的弥补这一劣势。本文综述了保护剂在微生物真空冷冻干燥中的应用状况,将目前使用的保护剂按照化学结构、来源、穿透能力、保护阶段等不同方法进行了分类;对常用的几种保护剂脱脂奶粉、海藻糖以及谷氨酸钠的保护机理及应用进行了介绍;并阐述了保护剂的增效途径,微生物冷冻干燥使用单一保护剂不足以得到理想的存活率,只有在合适的条件下对保护剂进行复配增效才能够使生防试剂、发酵剂等的商业化应用成为可能。

真空冷冻干燥,保护剂,保护机理,增效途径

在食品领域,微生物真空冷冻干燥技术主要应用在采后果蔬生防试剂、益生菌、发酵剂等的研究上,与其他保种技术相比,真空冷冻干燥技术可使菌悬液形成干粉方便运输、销售及使用[1],且形成干粉后微生物的生化反应降到最低可使贮藏期内干粉的生物、化学、物理性能保持相对稳定[2],再者冻干粉使用真空包装技术可使微生物免受贮藏过程中的污染[3]。然而真空冷冻干燥的微生物在经历了冷冻、干燥、贮藏三个阶段后,它的存活率受到严重影响,这也是目前限制真空冷冻干燥微生物商业化应用最重要的原因。

事实上,影响微生物真空冷冻干燥后存活率的原因主要有两方面,一方面是微生物自身,另一方面是冷冻、干燥、贮藏微生物的环境条件。其中对微生物自身来说,它的培养条件、微生物收获期、冷冻干燥前微生物的浓度均会影响冻干后微生物的存活率[4-6]。另一方面有研究表明,真空冷冻干燥后微生物存活率下降的最主要原因是冷冻干燥过程中冰晶的形成、高浓度胞内溶质引起的高渗透压导致微生物细胞膜破坏,此外脱水影响了亲水性大分子性能,蛋白质降解等最终影响了微生物的存活率[7]。

针对冷冻、干燥、贮藏等外部环境对微生物存活率造成的影响,可在菌悬液中加入合适的保护剂,减少或避免外部恶劣环境条件对微生物造成破坏,进而提高微生物的存活率,为其商业化应用提供可能。

1 保护剂的几种分类方法

1.1 按保护剂的化学结构进行分类

按保护剂的化学结构大体可将保护剂分为三类:糖类保护剂、蛋白类保护剂、其他。糖类和蛋白质是相关研究中应用最广泛的两类保护剂,是研究人员选择保护剂首要考虑的对象[8]。

糖类保护剂主要包括单糖、二糖、三糖。单糖中最常用的保护剂有:葡萄糖、果糖、半乳糖。二糖中最常用的保护剂有:海藻糖、蔗糖、乳糖。三糖中最常用的保护剂是棉籽糖。有研究表明单糖中半乳糖保护效果最好,三糖中棉籽糖对细菌的保护作用较好[9-10],二糖的保护效果普遍较好[11-13],Costa等对成团泛菌(Pantoeaagglomerans)进行研究,得出最佳的保护剂是海藻糖和蔗糖,当使用5g/100mL的海藻糖时,其存活率达到83%左右,当使用10g/100mL的蔗糖时,存活率达到75%左右[14]。糖类保护性能的不同源于它们与水结合能力和抑制细胞内外冰晶形成的差异[15],与是否能够参与代谢没有多大关系[16]。有研究表明二糖比三糖应用广泛是因为二糖比三糖对磷脂膜有更强的结合力[17]。

蛋白类保护剂主要包括牛乳蛋白、血清、大豆蛋白、胶原蛋白等,有研究表明蛋白质比糖类有更高的玻璃化转变温度,在冷冻干燥形成玻璃态方面,蛋白质比糖类扮演更重要的角色[1],此外蛋白质可在微生物细胞壁外形成保护性外膜[9]。0.1～4g/100mL的血清白蛋白很长时间被作为病毒和立克次体的冻干保护剂[18]。有研究表明,2g/100mL的类人胶原蛋白可使长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)存活率达到39.09%±1.27%[19]。Wang等以发酵豆奶作为保护剂可使长双歧杆菌(B.longumB6)的存活率达到43%～52%[20]。

1.2 按保护剂的来源进行分类

按保护剂的来源可将保护剂分为:内源性保护剂、外源性保护剂。前者是指微生物本身存在的或培养条件、周围环境改变使其自身合成的具有保护性的物质,后者是指冷冻前另加入菌悬液中以保护为目的的物质。此种分类研究方法主要针对的是海藻糖。有研究表明在冷冻干燥过程中,只有细胞膜两侧都存在海藻糖才能有效的保护酵母菌[21],酵母菌有特殊的海藻糖载体[22],但是Zayed等的研究证明冷冻前的时间不足以使细胞运输足够的海藻糖进入细胞内以提高酵母菌的存活率[23]。

最早研究发现很多酵母菌细胞内都存在一定量的海藻糖,它可使酵母菌在很多恶劣的环境中生存,例如高温、冷冻、干燥、高渗透压等。为了提高细胞质中海藻糖的含量,可在培养微生物过程中,用海藻糖[24]或柠檬酸[25]取代葡萄糖作为碳源以增加细胞中海藻糖的含量。也有研究表明冷冻前温和的热处理可使酵母菌菌体内海藻糖含量增加,而当酵母菌处于厌氧环境中生长时,它的海藻糖含量和抗冻能力降低[26]。Li等研究,使用5g/100mL或10g/100mL的海藻糖作为保护剂,与高含量的细胞内海藻糖相互作用,可使罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)和粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)两类拮抗酵母菌的存活率分别达到90%和97%左右[24]。

1.3 按保护剂的穿透能力进行分类

按保护剂的穿透能力可将保护剂分为三类:能够穿透细胞壁和细胞膜的保护剂、能够穿透细胞壁而无法穿透细胞膜的保护剂、既不能穿透细胞壁又不能穿透细胞膜的保护剂。穿透能力的不同反过来会影响它们对微生物的保护机制,保护作用大致可分为细胞内保护和细胞外保护[18]。此种分类方法最初是用来分类冷冻保护剂的。

能够穿透细胞壁和细胞膜的保护剂主要有二甲基亚砜、甘油等。二甲基亚砜和甘油是常见的冷冻保护剂,在微生物冷冻保种中发挥着重要作用。二甲基亚砜对一些生物系统具有毒性作用,毒性因微生物类别而异,在使用时,应该避免二甲基亚砜的浓度超过15%,且需要在解冻后对悬浮液进行离心或稀释。Tan等研究表明,5g/100mL的葡聚糖+7g/100mL的海藻糖+1%的二甲基亚砜可以使多孢节丛孢(Arthrobotryssuperba)的存活率达到35%左右[17]。对于加有甘油的悬浮液很大程度上会延长干燥时间,若干燥不完全,甘油对冻干菌有负面作用[27],但也有研究得出乳酸菌在中性环境的存活率要高于酸性环境的存活率,甘油有助于克服酸性环境给乳酸菌带来的不良影响[28]。南君勇等研究表明5%的甘油可以使热带假丝酵母(Candidatropical)的存活率达到28%左右[29]。此类保护剂可以在冷冻时形成玻璃态,抑制冰晶的形成,防止高渗透压引起的盐类毒性对细胞膜造成破坏。

能够穿透细胞壁而无法穿透细胞膜的保护剂主要有氨基酸、分子量较小的聚合物例如PEG-1000。此类保护剂可以在细胞膜和细胞壁之间形成缓冲层,抑制冰晶的形成,保护细胞膜。有研究表明1g/100mL的PEG可以使热带假丝酵母(C.tropical)的存活率达到28%左右[30]。常见的氨基酸保护剂有谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸等。有荧光探针检测到当菌悬液中加入谷氨酸或天冬氨酸会使细胞磷脂膜变得无序,促使细胞膜流动性增强,干燥后存活率上升[31],Yang等研究表明0.1g/100mL的L-半胱氨酸可以使长双歧杆菌(B.longum)的存活率达到25.54%±0.52%[19],也有研究表明天冬氨酸、脯氨酸对乳酸菌没有保护作用[28]。

既不能穿透细胞壁又不能穿透细胞膜的保护剂主要指较高分子量的聚合物,例如蛋白质、多糖、葡聚糖等。此类保护剂可在细胞表面形成粘性层,保护细胞。Ashwood-Smith等研究认为PVP能够与过氧化氢酶连接起到保护作用[32]。而Lodato等研究PVP对酵母菌的保护效果不佳[21]。羧甲基纤维素和羟甲基纤维素作为保护剂可为干粉提供一个较轻的多孔结构,但是不容易复水[10]。

1.4 按保护剂的保护阶段进行分类

按保护剂的保护阶段可将保护剂分为:冷冻保护剂、干燥保护剂、贮藏保护剂。此种分类方法是由保护剂在某个阶段所起主要作用而分类的,事实上有些保护剂的保护作用是交叉的,可能在三个阶段都起作用,例如海藻糖等[11]。甘油和二甲基亚砜是优良的冷冻保护剂,在微生物冷冻保种中的作用不可忽视,但随着真空冷冻干燥技术的发展,一些冷冻保护剂被广泛应用到冻干领域。但也有研究人员证明添加一定量的冷冻保护剂到冻干保护剂中并没有提高真菌的存活率[17]。

一般认为冷冻保护剂和干燥保护剂在冷冻干燥的不同阶段发挥主要作用,添加冷冻保护剂的作用是减少细胞内冰晶的形成,冷冻保护剂能够促进微生物悬浮液玻璃态的形成、抑制冰晶的形成,防止形成的冰晶破坏细胞膜和蛋白质[33]。同时研究表明,干燥过程中干燥保护剂能够取代水分子吸附在磷脂、蛋白质表面,与磷脂双分子层相互作用,降低它从液晶相到刚性凝胶相的温度[34]。

有些物质可阻止或降低冷冻干燥过程对微生物的不良影响,而无法在贮藏过程发挥保护作用。有研究表明,在贮藏期中,有可能因为氧化作用而对微生物存活率造成影响,因此一些抗氧化剂被用作贮藏保护剂,例如抗坏血酸钠[22]、硫代硫酸钠[34]等,甚至一些糖类在贮藏过程中也可起到抗氧化的作用,Benaroudj等研究海藻糖可作为自由基清除剂消除氧自由基对微生物的影响[35],此外有研究证明谷氨酸钠在冻干酵母菌贮藏过程中发挥重要作用[36]。除氧化作用对微生物存活率有影响外,高水分含量的干粉对微生物贮藏稳定性也有负面作用,相反玻璃态的形成可减弱微生物贮藏过程中生化反应的发生,而糖类可以促进干粉玻璃态的形成,这也是糖类成为贮藏保护剂的原因之一[37]。

综合以上几种分类方法,一个优良的保护剂首先要能够使冻干的菌种达到一定的存活率,同时要保证冻干后菌种的功能性不会减弱,例如拮抗酵母菌分泌胞外水解酶的能力、发酵剂的发酵能力、益生菌分泌抗菌物质的能力[24,38]等,其次还要求加入保护剂后悬浮液能够在一定的时间内冻干,并且容易复水[27],再者应确保保护剂本身不具有毒性、不易分解,此外对于要进行商业化应用的冻干制剂,还应该考虑保护剂的成本问题。

2 常用的几种保护剂及保护机理

保护剂的选择很大程度上取决于微生物的种类,但也有一些保护剂是适用于很多种微生物的,这其中包括脱脂奶粉、海藻糖、蔗糖、乳糖、谷氨酸钠等。

2.1 脱脂奶粉的保护机理及应用

脱脂奶粉是一个混合物,它包括乳糖、蛋白质、盐类、维生素等。脱脂奶粉中的蛋白质为细胞提供了一个保护性外膜[9],经研究证明其中的Ca2+可以提高微生物冷冻干燥后的存活率,此外脱脂奶粉中的磷酸盐和柠檬酸盐可以起到缓冲作用,稳定pH[23]。

但其实也有研究表明,单独使用脱脂奶粉作为保护剂微生物的存活率并不是很高,Berny等研究使用脱脂奶粉作为保护剂,酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)存活率是30%左右,酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis)的存活率较低,而对葡萄串状节丛孢(Arthrobotrysarthrobotryoides)没有起保护作用[10]。所以很多研究者认为脱脂奶粉能被广泛应用,是因为它可作为一种赋形剂,为干粉提供较轻的多孔无定型结构,容易复水[7]。在很多研究中,采用高浓度的脱脂奶粉和其他物质复合来提高微生物的存活率。Polomska等研究冻干酵母菌,单独使用10g/100mL的脱脂奶粉,球形假丝酵母(Candidasphaerica)的存活率是20%左右,当10g/100mL的脱脂奶粉+10g/100mL的谷氨酸钠作为保护剂,它的存活率达到50%左右,当10g/100mL的脱脂奶粉+10g/100mL的海藻糖或10g/100mL的脱脂奶粉+10g/100mL的海藻糖+10g/100mL的谷氨酸钠作为保护剂,它的存活率达到80%左右[38]。

2.2 海藻糖的保护机理及应用

海藻糖能够有效提高微生物冻干后的存活率,曾在很长一段时间被认为是为微生物提供碳源[35],然而更多的研究结果表明,海藻糖在稳定细胞膜结构和蛋白质结构方面起着重要作用,而细胞膜物理状态的改变以及蛋白质的变性是造成微生物死亡的直接原因[39]。

海藻糖的保护机理主要体现在两方面,首先在冻干过程中,细胞内冰晶的形成破坏细胞膜、造成胞内渗透压上升、胞内溶质浓度升高产生毒副作用,海藻糖的加入可提高菌悬液的玻璃化转变温度,使菌悬液形成玻璃态[37],敏感性物质嵌入到玻璃态中[21],同时分子移动性降低,对酶也有很好的保护作用[34]。此外根据水代替假说[11],在冻干过程中,海藻糖能够代替水分子与细胞膜和蛋白质上的亲水基团形成水合键,保持蛋白质结构和功能的稳定,避免细胞膜失水后,烷基链聚合,使细胞膜从片状转为凝胶状或六角状,造成细胞内物质的泄露[33]。Cerrutti等研究表明内源性海藻糖的保护原理也与细胞膜稳定性、酶活力的保存有关,而对酵母菌来说干燥后其存活率在很大程度上取决于细胞内的海藻糖含量[40]。

Yang等对长双歧杆菌(B.longum)研究,发现单独使用保护剂时,10g/100mL的海藻糖的保护效果最好,其存活率达到53.22%±2.21%[19]。很多研究认为海藻糖的保护性能优于蔗糖[41],这主要也是由于海藻糖的玻璃化转变温度高于蔗糖,海藻糖还可以形成二水化合物,因此悬浮液中少量水可以被析出,使得剩余的物质形成玻璃态[12],Patist等还表示,与蔗糖和麦芽糖相比,海藻糖两个单体之间的伸缩性、柔韧性更好,因而与大分子的极性基团相互作用也更强,再者海藻糖能够瓦解水的四面体结构,减少结晶水的形成[33],但是海藻糖的成本在一定程度上限制了它的使用。

2.3 谷氨酸钠的保护机理及应用

谷氨酸钠作为冻干保护剂其应用远没有脱脂奶粉和海藻糖广泛,然而谷氨酸钠独特的保护机理也受到很多研究者的青睐。曾有研究人员对氨基酸进行大量研究,认为谷氨酸中的-NH2、α-COOH和γ-COOH对微生物起到保护作用,在干燥过程中,谷氨酸钠与水的密切作用使干粉保留了适量的水分,满足了微生物维持生命的最低需求[42]。此外研究表明谷氨酸钠还具有抗氧化作用,抑制三酰甘油的氧化和自由基的形成,以防止对细胞膜造成不可逆转的破坏[38]。

有研究表明,以2.5%的谷氨酸钠作为保护剂冻干酒类酒球菌(Oenococcusoeni),贮藏6个月后的存活率与冻干后直接测得的存活率分别是71.3%和72.4%,表现出较好的贮藏稳定性[15]。但也有研究表明,单独使用谷氨酸钠对微生物保护作用不大,王华等研究热带假丝酵母(C.tropical)发现,当使用7g/100mL的谷氨酸钠作为保护剂,该菌的存活率为27.92%,采用响应面法得出14.15g/100mL的蔗糖+7.07g/100mL的谷氨酸钠+1.1g/100mL的聚乙二醇为保护剂,它的菌体存活率可达到81.46%[30]。

3 保护剂的增效途径

对于单个保护剂的增效途径,首先可通过大分子保护剂与小分子保护剂结合、渗透性保护剂与非渗透性保护剂结合、糖类保护剂与蛋白类保护剂结合等理论复合保护剂使其达到增效、协同的作用[1,18]。南君勇研究热带假丝酵母(C.tropical),通过单因素、正交实验,当使用5%的甘油+5g/100mL的脱脂奶粉+10g/100mL的蔗糖+15g/100mL的β-环状糊精可使该菌的存活率达到82.86%左右[29]。Li等研究表示,用柠檬酸取代葡萄糖培养酵母菌可使酵母菌体内产生大量的海藻糖,再另加10g/100mL半乳糖和5g/100mL脱脂奶粉作为保护剂,其存活率可达到96.1%±2.5%[25]。Huang等通过响应面法,得出德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)的最佳保护剂是6.64g/100mL的蔗糖+10.12%的甘油+11.3g/100mL的山梨糖醇+13g/100mL的脱脂奶粉,它的存活率可达到86.53%[7]。

此外保护剂还可以与无机盐类混合,以提高微生物的存活率。研究表明对于某些病毒、嗜盐微生物,添加Mg2+和Ca2+等可以显著提高存活率,然而对于某些真核微生物通常会造成渗透压伤害[18]。Conrad等研究表明,添加硼酸盐到海藻糖中能够有效提高嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)的存活率,硼酸盐分子与海藻糖分子相互缠结,形成类似多聚物的分子,提高海藻糖的玻璃化转变温度,与小分子结合,在冷冻和干燥过程中保护酶[34]。而Tan等研究人员表示添加CaCl2、MgSO4到葡聚糖和海藻糖中,没有提高多孢节丛孢(A.superba)的存活率[17]。

大量研究表明,预先将微生物暴露在较温和的恶劣环境中可以增强它在后续相同极端环境或另一类极端环境中的抗逆能力,这种现象称为获得性抗逆能力或交叉保护能力,微生物常见的抗逆能力主要体现在它对冷、热、酸的应激反应[26]。Diniz-Mendes等研究,酿酒酵母(S.cerevisiae)冷冻前在40℃的条件下热浴60min,贮藏7d后与对照组相比,其存活率提高了7倍,究其原因可能是冷冻前的热处理使酵母菌菌体内产生抗热蛋白和海藻糖,此外该菌冷冻前在10℃条件下放置3h也可提高冻干存活率,但其原因与热处理不同,具体保护机理还有待进一步研究[43]。Benaroudj等也得出类似结论,酿酒酵母(S.cerevisiae)冷冻前,38℃热处理或蛋白酶体抑制剂的诱导可以使酵母菌菌体内积累大量的海藻糖[35],提高其存活率。Son等表明,酿酒酵母(S.cerevisiae)分别在pH=3.5和pH=5.2的环境中培养,冻干后前者的存活率大于后者的存活率,主要原因是在低pH条件下,菌体糖原增多、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例上升,能够使细胞膜保持最佳的膜质秩序[26]。

4 展望

保护剂的选择是微生物真空冷冻干燥过程中极其重要的环节,它的保护效力因微生物而异,这种差异不仅表现在细菌和酵母菌之间,甚至酵母菌的不同种间也存在区别,同时在研究过程中,也应关注微生物的初始浓度、保护剂的浓度、干粉的贮藏温度、干粉的复水等才能较好的维持它的保护效力。未来保护剂的发展趋势主要有如下几方面:应用差示量热扫描仪、近红外光谱仪、扫描电镜等仪器测定保护剂的玻璃化转变温度、观察保护剂玻璃态的形成,辅助判断它们的保护能力[2,13,21,44];保护剂可以不仅仅局限在菌悬液冻干前添加,已有较少的研究证明,在培养基或干粉复水时添加保护剂,可以分别增强菌种的抗逆能力和修复能力[8,11,25];使用细胞固定技术、微胶囊技术,将海藻酸钠、果胶等保护剂应用到冻干制剂中,增强菌种的稳定性[45-46];筛选特殊的保护剂,使其既能够保护菌种,又能够发挥与菌种相似的作用,例如可以选择一种生物保鲜剂作为冻干拮抗酵母菌的保护剂,一举两得。

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Application of protectants in freeze-dried microorganism

NIU Xiao-ying1,DENG Li-li1,ZENG Kai-fang1,2,*

(1.College of Food Science,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agro-products on Storage and Preservation(Chongqing)Ministry of Agriculture,Chongqing 400715,China)

The lower viability of freeze-dried microorganism restricts the development and application of fruits and vegetables biocontrol agents,probiotics and starter cultures in some extent,but adding the appropriate protectants can compensate such deficiency widely. This paper summarized the application of protectants in lyophilization,and classifies the protectants from different angles,such as chemical structure,source,permeability,protective phase,and selects some common protectants,such as skimmed milk powder,trehalose,sodium glutamate,to illustrate their protective mechanism and applications. Besides,the paper introduced symergistic methods of protectants to show that using only one protectant during freeze-drying can not achieve ideal viability and the synergism of different protectants will make the commercialization of biocontrol agents and starter cultures possible.

freeze-drying;protectant;protective mechanism;synergistic methods

2014-05-28

牛晓影(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

*通讯作者:曾凯芳(1972-)，女，博士，教授，研究方向：农产品加工与贮藏工程。

国家自然科学基金项目(31271958)；重庆市科技攻关(应用技术研发类/重点)项目(cstc2012gg-yyjsB80003)；教育部留学回国人员科研启动经费(45批)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)01-0390-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.074