高分子大孔微球的制备和结构控制

周炜清，李娟，那向明，马光辉

（中国科学院过程工程研究所国家生化工程重点实验室，北京 100190）

引言

高分子多孔微球是一种具有高附加价值的化工产品，在很多领域都具有重要的应用，例如作为吸附分离填料、催化剂载体、药物缓控释制剂等。根据孔径大小的区别，多孔微球通常分为微孔（<2 nm）、介孔（2～30 nm）、大孔（30～100 nm）和超大孔（>100 nm），微球的结构控制是在不同领域获得成功应用的保障。例如，药物分离纯化的填料，孔径越小往往比表面积越高、载量越大，但小孔径会造成相对分子质量较大的生物分子难以进入孔道，或者进入孔道后受到剪切力的影响，致使活性降低。微球应用于药物缓释制剂时，结构决定了缓释行为、与体内细胞相互作用等，因此需要针对不同的应用设计结构合理的微球。本文主要介绍作者所在的研究团队在大孔和超大孔微球的制备、结构调控以及应用等方面的研究进展。

孔径大于100 nm的超大孔微球在超大生物分子（疫苗、抗体等）的分离纯化、固定化酶等方面具有独特的特点。以作为乙肝疫苗分离纯化介质为例，超大孔微球展现了流速快、分离效率高的特点，同时更为关键的是，乙肝疫苗的活性收率比常规介质大幅提高（分别为 40%和 10%）。与大孔微球的制备技术相比，由于利用有机溶剂与聚合物之间的相分离一般只能获得数十纳米的微球，必须发展新的过程来制备超大孔微球。分别发展了反胶团溶胀法和 W/O/W 复乳法，得到以不同材料为基质的、孔径在百纳米级以上可控的超大孔微球。

1 新型超大孔微球的制备和结构调控

制备大孔微球的常规方法是利用有机溶剂制孔剂和聚合物之间的相分离制备出孔道，但是这种方法很难得到百纳米级以上的微球，因此，发展了新的制备过程来制备超大孔微球，利用水和疏水性聚合物之间相分离程度远大于有机溶剂与聚合物间的相分离程度的特点，获得超大孔微球。这一过程中，如何将水作为制孔剂导入液滴内是一个难点。发展了两种方法，一种是反胶团溶胀法，一种是复乳液法。

1.1 反胶团溶胀法制备疏水性超大孔微球

如图1所示，将足够量的油溶性表面活性剂溶解在苯乙烯（styrene，ST）中，然后将 ST分散在水相中，形成O/W型乳液，表面活性剂在油相中形成反胶团，反胶团能够从水相中吸入大量的水而形成水的微通道，升温聚合后聚合物相和水相继续发生相分离，最终形成较大的微水相通道，除去水相即可得到超大孔微球[1-3]。从上述成孔机理可知，影响反胶团吸水溶胀过程以及水-聚合物相分离的因素也会对最终得到的孔道结构造成影响。主要的影响因素包括：表面活性剂的添加量、表面活性剂的类型和稀释剂。

表面活性剂的添加量对孔径的尺寸有重要影响，当采用Span 80为表面活性剂，含量为30%（以ST和DVB的总质量为基准）时，孔径较小，仅为50 nm。当Span 80含量增至40%时，PST微球的孔径可达到500 nm（图2）。同时，孔容由1.62 mL·g-1增加至2.65 mL·g-1，孔隙率由65.5%增加至83.6%。孔径和孔隙率的迅速增加只靠表面活性剂量的增加是达不到的，凸显了反胶团从外水相中吸收水的重要作用[1]。

另一个影响反胶团吸水溶胀过程的主要因素是表面活性剂的亲水亲油平衡值（HLB值）[3]。使用电导测定的方法，考察了不同表面活性剂对反胶团吸水溶胀形成的乳液结构的影响。对于选择的四种表面活性剂Span 85（HLB 1.8）、Span 80（HLB 4.3）、PO-500（HLB 4.9）以及Span 80-Tween 80复合表面活性剂（HLB 9.65），含有Span 85的体系，由于其疏水性较强，Span 85在油相中的溶解性更好，它的反胶团也相对比较稳定，不容易聚集到一起，这就造成碰撞概率较低、通道的尺寸较小（图3）。聚合结果[图4（a）]，也反映了这一点。含Span 80-Tween 80复合表面活性剂的体系，其电导率行为与其他体系有很大不同，它的电导率增长十分迅速。这是由于复合表面活性剂的亲水性强（Span 80和Tween 80的质量比为1∶1，HLB值为9.65），吸入水后，表面活性剂反胶团更容易聚集在一起，这使电导率迅速上升。从该体系聚合物微球的 SEM 图可以看出[图4（d）]，球内形成了一个大的空腔，这也揭示了电导率如此之高的原因。

图1 反胶团溶胀过程制备超大孔微球的机理示意图Fig.1 Illustration of formation mechanism of gigaporous microsphere by reverse-micelle swelling process

图2 孔径为500 nm的超大孔聚苯乙烯微球的电镜照片（a）和不同Span 80含量制备的微球的孔径分布曲线对比（b）Fig.2 SEM image of gigaporous PST microspheres (pore size 500 nm) (a) and pore size distribution curves of microspheres prepared by different Span 80 content

1.2 胶团溶胀法制备亲水性超大孔微球

图3 不同表面活性剂对乳液电导率的影响Fig.3 Effects of different surfactants on conductivity of W/S/O emulsion (surfactant concentration 40%)

图4 不同表面活性剂制备的微球Fig.4 Polymer particles prepared with different surfactants(Preparation condition：ST 3.0 g; crosslinking degree：13.8%; amount of surfactant 40%)

在上述实验基础上，进一步考察了亲水性超大孔微球如琼脂糖微球的制备。亲水体系超大孔微球的制备过程与疏水体系相似，但是需要将水溶性表面活性剂加入水相中，形成胶团，再将水相分散于油相，胶团的疏水内核会把外油相吸入水相中进而溶胀，水相液滴固化后形成超大孔微球。同样，影响微球结构主要因素包括表面活性剂的类型与用量，与疏水体系的差别之一，在于还需要考虑动力学因素的影响。由于亲水体系水相（琼脂糖溶液、葡甘聚糖溶液等）的黏度远远大于苯乙烯等单体体系，吸油过程中，油相向水相内的扩散缓慢，必须给予足够的溶胀时间，才能够形成大孔结构（图5）。

图5 吸油溶胀时间对琼脂糖微球表面形貌的影响Fig.5 Effect of oil-absorbing duration on morphology of agarose microspheres

此外，以亲水高分子为出发原料制备超大孔微球时，微球结构同样会受到热力学和动力学因素的影响。由于向水相中添加了大量表面活性剂，水相性质发生变化，以琼脂糖体系为例，水相黏度和油水界面张力下降，琼脂糖的凝胶化温度也因此改变。而凝胶化温度附近的温度变化对孔道形成的影响很大，因此测定了加入表面活性剂后的琼脂糖溶液的凝胶化稳定。通过测定凝胶体系的弹性模量G′和黏性模量G″随温度变化的曲线，得到二者交点对应的温度即为体系由溶液状态向凝胶状态转变的临界温度，即为体系的凝胶化温度，如图6所示。

图6 预引入表面活性剂后琼脂糖体系凝胶化温度的确定Fig.6 Determination of gelating temperature of agarose system containing surfactant

结果表明，当水相中引入表面活性剂后，凝胶化在43℃时发生，这比未加表面活性剂的琼脂糖溶液（36℃）有所上升。即当含有表面活性剂的琼脂糖溶液温度降低至43℃左右开始凝胶化，继续降温至40℃以下，固化基本结束，此时体系由流动性良好的溶液转变为不可流动的凝胶。于是，重点考察了30～50℃温度范围内，固化速率对琼脂糖微球孔道结构的影响。在其他制备条件不变的情况下，分别以0.1、0.5、10℃/min进行固化，所得琼脂糖微球的电镜照片如图7所示。

从图中可以看出，固化速率越慢，所得琼脂糖微球孔径越大。当固化速率降低至 0.1℃/min时，微球表面大孔清晰可见，甚至可以观察到微米级的超大孔结构。随着固化速率的加快，凝胶孔径呈下降趋势。如果以10℃/min的速度迅速固化，琼脂糖纤维束内形成的氢键数量有限，纤维束结构较疏松，束间容易发生聚集，导致孔径明显减小。

1.3 复乳法制备超大孔微球及其结构调控

将水相导入油滴内的另一个方法为复乳法，将内水相分散在聚合物溶液中制备成W1/O初乳，然后将初乳继续分散在外水相中制备成 W1/O/W2复乳，最终除去溶解聚合物的有机溶剂，并调控溶剂去除过程，使内水相在溶剂去除过程中相互融合形成贯穿孔，最终获得超大孔微球[4]。

图7 不同固化速率下琼脂糖微球的电镜照片Fig.7 SEM images of porous agarose microspheres obtained with different solidification rate

复乳液是典型的热力学不稳定体系，一般存在油滴间相互融合、内腔间融合、内水相逃逸、内腔收缩4种演变过程。对于近乎所有的多腔复乳液滴，这4种演变是同时存在的，不同阶段会表现出不同的主导方向。其中，界面稳定性和分子扩散是影响复乳演变的关键因素。复乳液固化也是一个动态过程。当固化速率明显快于复乳演变过程时，微球、微囊会保留乳液模板的形态特征，如各种微囊结构；当固化过程伴随着形态演变时，将会形成超大孔微球。通过复乳液演变与复乳液固化对超大孔微球进行结构调控，如图8所示。

图8 复乳液演变与复乳液固化对超大孔微球结构的调控Fig.8 Morphology evolutions of W1/O/W2double emulsion and solid microcapsules illustrated by cartoon chart

以聚乳酸-聚乙二醇（PELA）为出发原料为例，如图9所示，分别对界面稳定性和分子扩散进行了控制。界面稳定性方面，在外水相中添加聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA），而在内水相中未添加任何表面活性剂，其目的在于创造较为稳定的O/W2界面和相对不稳定的W1/O界面，从而使得演变只发生在油滴内部，减少了内水相向外逃逸。在分子扩散方面，使复乳先熟化6 h，等内水相之间发生一定融合后再固化，固化过程中内水相和外水相也发生一定的融合，便可获得具有贯穿孔的超大孔微球。如果使复乳熟化更长的时间再固化，内水相之间会发生更多的融合，甚至融合为单一腔室，无法获得理想的超大孔微球。

2 微球结构对应用效果的影响

2.1 微球介质的孔径对分离效果的影响

多聚亚基蛋白质、抗体、PEG-蛋白质偶联物等超大生物分子药物的发展非常迅速，对分离纯化提出了高的需求。这些超大生物分子的相对分子质量很大或者水力学半径大，而现有一般介质孔径小，超大生物分子进入介质速度慢，甚至进入不了介质内部，造成分离困难。对上述合成的PST超大孔微球进行进一步亲水化处理并改性后，用于超大生物分子的分离[5-10]。以乙肝疫苗的分离纯化为例[11]，孔径为280 nm超大孔介质在高流速、高分离效率的同时，还展示了更高的载量、活性回收率和纯化倍数（图 10）。其原因在于超大孔结构能够有效减少抗原的多位点吸附并降低了乙肝疫苗的亚基解聚。

2.2 微球孔径对固定化酶的影响

图9 不同复乳演变时间的液滴固化后的扫描电子显微镜照片Fig.9 SEM images of W1/O/W2emulsion templated microcapsules after different ripening time

图10 用不同的DEAE弱阴离子交换介质分离纯化乙肝表面抗原的结果比较（载量、回收率、纯化倍数）Fig.10 Separation results (loading quantity, HBsAg recovery, purification fold) of HBsAg by using different microspheres as separation media

图11 不同温度下固定化酶的热稳定性Fig.11 Effect of temperature on enzyme thermal stability at two different temperatures

图12 固定化酶的重复利用性Fig.12 Reusability of immobilized enzyme in stimulant system of olive oil hydrolysis (a) and in real system ofp-NPP hydrolysis (b)

酶在载体上的固定化，根本上也是蛋白与界面的作用。在上述超大孔微球用于生物大分子取得良好效果的基础上，进一步考察了作为酶固定化载体的效果，也取得很好的结果。在不同孔径的聚苯乙烯（PST）微球上进行了脂肪酶（amano lipase PS,fromBurkholderia cepacia）的固定化，选用的PST微球分别为介孔微球（14 nm）、大孔微球（100 nm）和超大孔微球（300 nm）[12]。发现超大孔微球固定化酶的热稳定性显著增加，如图11所示。在50℃条件下，无论何种固定化酶，其酶活在6 h后仍保持在80%以上。当温度升高到70℃时，经过6 h的处理，不同孔径载体上的固定化酶酶活出现显著差异。考察固定化酶的贮存稳定性时，从酶的脱落情况来看，常温储存15 d后，超大孔微球固定化酶几乎没有蛋白脱落，而大孔和介孔微球的固定化酶分别有 5%和 15%的脱落。从酶活保持来看，在保存了15 d后，介孔微球固定化酶的酶活不足10%，而相同条件下的超大孔和大孔微球的固定化酶分别保留了 67.5%和 63.3%的活性。在重复使用性的对比中，超大孔微球固定化酶也显示出显著的优势（图12）。由于3种固定化酶载体都是聚苯乙烯基质，固定化酶结果的差异也证明了不同的孔道结构对酶分子结构的影响。

3 结 论

本文针对大孔和超大孔微球的制备和结构控制进行了系统的研究，并探讨了微球的结构对其应用效果的影响，得出以下结论。

（1）利用反胶团溶胀法和复乳法，成功将水致孔剂导入液滴内，制备出了超大孔微球（孔径>100 nm）。系统研究了孔道形成机理和各主要因素对于孔结构的影响规律，建立了不同基质超大孔微球的制备和结构调控方法。

（2）利用微球的结构可控性，研究了不同结构的微球作为蛋白质分离纯化介质和固定化酶载体的应用效果。超大孔介质大幅度提高了超大生物分子乙肝疫苗的吸附载量、纯化回收率和纯化倍数。作为固定化酶载体能够有效提高酶活、酶的稳定性和重复使用次数。

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