血管内皮生长因子激酶功能区受体基因沉默抑制肺癌A549细胞增殖并增强其对多西他赛的敏感性

张秀义

·基础研究·

血管内皮生长因子激酶功能区受体基因沉默抑制肺癌A549细胞增殖并增强其对多西他赛的敏感性

张秀义

目的研究沉默血管内皮生长因子激酶功能区受体(kinase-domain insert containing receptor,KDR)基因对人肺癌A549细胞增殖以及对化疗药物多西他赛敏感性的影响。方法设计合成KDR的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)序列，LipofectamineTM2000转染入A549细胞。通过反转录-聚合酶链反应和Western Blot检测KDR基因沉默后KDR mRNA及蛋白的表达情况，利用流式细胞仪检测A549细胞的周期变化。采用四甲基偶氮唑盐比色法及细胞克隆形成实验观察，沉默KDR基因后A549细胞对多西他赛的敏感性。结果KDR基因经48 h沉默后，A549细胞的KDR基因和蛋白的表达出现较明显的下降(P<0.05)。A549细胞的周期在G0/G1期阻滞，S期细胞数目减低(P<0.05)。在KDR基因沉默组，A549细胞对多西他赛的敏感性有明显的增强(P<0.05)。结论KDR-siRNA能够明显沉默A549细胞KDR基因和蛋白的表达，并能抑制A549细胞的增殖，增强其对多西他赛的敏感性。

血管内皮生长因子激酶功能区受体；小干扰RNA；肺癌；A549细胞；细胞增殖；多西他赛

在全世界范围内肺癌的发病率最高，且发病过程是一个多因素、多步骤的渐进过程，已经严重威胁到人类的健康[1-3]。近些年来，随着人类基因组计划的完成和功能基因学的不断发展，人们发现肿瘤细胞的增殖、迁移与基因的调控有关，涉及多种基因复杂的激活、失活，为临床提供了新的有效治疗肿瘤途径[4-6]。研究发现，血管内皮生长因子激酶功能区受体(kinase-domain insert containing receptor,KDR)基因在肺腺癌细胞增殖中发挥重要作用，可作为肿瘤治疗的新靶点[7-8]。KDR是介导血管内皮生长因子在肿瘤新生血管形成中发挥功能的特异性受体，与恶性肿瘤的增生有关。本研究将合成的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)转染入肺癌A549细胞，分析siRNA对KDR基因沉默的效率；研究沉默KDR基因后，肿瘤细胞周期的变化及其对多西他赛敏感性的影响,为RNA干扰KDR基因治疗肺癌或作为增敏药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌A549细胞购自南京凯基生物科技有限公司；达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s meuium,DMEM)、无血清Opti-MEM培养基(伊格尔最低限度必需介质培养基改良型)、G418培养基、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自杭州四季青公司；脂质体转染试剂LipofectamineTM2000和TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain rea-ction，RT-PCR)两步法试剂盒购自大连TaKaRa公司，禽成髓细胞瘤病毒反转录试剂盒由重庆将来试剂公司提供；互补DNA(complementary DNA，cDNA)合成试剂盒购自日本TOYOBO公司；RNA干扰序列购自广州锐博生物科技有限公司；PCR引物序列为美国Invitrogen公司化学合成；细胞计数试剂盒购自上海炎彬化工科技有限公司；鼠抗3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)单克隆抗体、兔抗人KDR多克隆抗体购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)标志的兔抗羊免疫球蛋白G购自美国Invitrogen公司；聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)购自美国Bio-Rad公司；二辛可酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量试剂盒、放射免疫沉淀分析蛋白裂解液购自北京赛百盛基因技术有限公司；电化学发光(electrochemical luminescence，ECL)试剂盒购自美国Invitrogen公司；Matrigel凝胶购自美国BD公司；全自动酶标仪购自美国Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA设计、合成及转染 依据文献[9]KDR-siRNA、阴性对照组siRNA SCR(scramble siRNA)序列分别为正义链5′-GCCACCAUGUUCUCUAAUATT-3′和反义链5′-UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT-3′、正义链5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′和反义链5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′，均由上海吉玛制药技术有限公司合成；肺癌A549细胞培养于含10%FBS的DMEM中，于37 ℃恒温、5% CO2、饱和湿度的密闭式孵箱内培养，扩增传代。取对数生长期的细胞用于实验。按每孔2×105个将A549细胞接种于6孔板中，当融合率达80%时通过脂质体法进行细胞转染。转染时分为3组：转染pGenesil-1-KDR-siRNA载体为A549/KDR-siRNA组(实验组)，转染siRNA载体为A549/control组(对照组)，未转染的肺癌A549细胞为A549组(空白组)。于转染后48 h进行RNA干扰效应的检测。

1.2.2 半定量RT-PCR检测 弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤细胞3次，TRIzol法提取细胞总RNA，经cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA。分别扩增KDR和内参GAPDH。KDR正义链5′-CTGGCATGGTCTFCTGTGAAGCA-3′，反义链5′-AATACCAGTGGATGTGATGCGG-3′，扩增产物795 bp；内参照GAPDH正义链5′-CGTGGAAGGACT CATGACCA-3′，反义链5′-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3′，扩增产物为509 bp。PCR反应条件为94 ℃变性2 min，按94 ℃变性45 s、62 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min进行反应，循环35次，再于72 ℃延伸8 min。用2%琼脂糖水平板电泳，经100 V电压电泳45 min。用凝胶自动成像及分析系统，以KDR/GAPDH光密度值(optical density，OD)作为mRNA表达的相对强度。

1.2.3 Westem Blot检测 弃去培养液，用PBS冲洗细胞3次，并提取总蛋白，经BCA法测定蛋白质浓度，吸取50 μg总蛋白，去离子水补至20 μL，置入等体积2×上样缓冲液，99 ℃变性10 min。离心，取50 μg蛋白行电泳，电转移印迹到PVDF上，封闭液中孵育1 h；加入1∶1 000稀释的KDR一抗4 ℃过夜；0.01 mmol/L TBST(10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、150 mmol/L NaCl、8 mmol/L叠氮钠、0.01%吐温-20,pH 7.5)洗膜5 min，共3次；加入1∶5 000 HRP标志的二抗及GAPDH，37 ℃孵育2 h；PBS洗涤，并采用ECL法检测。暗室曝光X线片后，经Uvitec公司凝胶成像系统摄像，采用Image-Pro Plus 7.0软件分析条带的OD，以KDR/GAPDH代表KDR的相对表达量。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期 收集每组的A549细胞，将细胞调整为1×106/L，再经PBS冲洗2次后，细胞沉淀用4 ℃的70%冷乙醇混匀后备用，洗涤细胞，后再用PBS调整细胞为1×106/L与含50 μg/mL RNA酶的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH 7.4)共同孵育30 min。100 μg/mL碘化丙啶进行细胞的DNA染色，在暗室中置1 h后经过流式细胞仪检测得A549细胞的DNA含量分布，并且计算出每个周期细胞的百分率。

1.2.5 四甲基偶氮唑盐比色法检测沉默KDR后A549细胞对多西他赛的敏感性 细胞转染KDR-siRNA 48 h以后，收集各组的A549细胞，并将其接种到96孔板中，每个样本设立3个复孔，待细胞贴壁后，分别加入多西他赛(6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L)培养48 h后，每孔加入四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)]20 μL(质量浓度为5 mg/mL)，放置于孵箱内4 h后弃掉上清液后再将其加入到10%的十二烷基磺酸钠200 μL中过夜。将其震荡15 min，用全自动酶标仪检测570 nm处的OD(OD570)。抑制率(%)=[(OD570对照组-OD570实验组)/(OD570对照组-OD570空白组)]×100%。

1.2.6 平板克隆检测沉默KDR后的A549细胞对多西他赛的敏感性 细胞在转染KDR-siRNA 48 h后，将各组A549细胞进行收集，并接种置6孔板，每个样本设立3个复孔，等细胞出现贴壁后，将其分别加入多西他赛(6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L)培养液中培养7 d，弃掉培养液，用PBS冲洗2次，经95%乙醇固定10 min后，再经吉姆萨染液染色10 min后冲洗、晾干，根据下面的公式，用Quantity One软件计算克隆形成的抑制率。克隆形成抑制率(%)=[1-(实验组克隆数/对照组克隆数)]×100%。

1.3 统计学处理 应用SPSS 19.0软件，计量资料组间比较行单因素方差分析，2组间的连续变量比较采用t检验，多组间的连续变量比较采用方差分析方法、协方差校正，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KDR-siRNA抑制KDR mRNA的表达 KDR mRNA表达的RT-PCR检测与对照组、空白组比较，实验组条带明显变窄，差异均有统计学意义(P<0.05，图1)。

2.2 siRNA抑制KDR蛋白的表达 KDR蛋白表达的Western Blot检测与对照组、空白组比较，实验组条带显著变窄，其OD比较差异有统计学意义(P<0.05,图2)。

图1 RT-PCR检测A549细胞中KDR mRNA的表达

图2 Western Blot检测A549细胞中KDR蛋白的表达

2.3 流式细胞仪检测细胞周期 经流式细胞仪分析A549细胞的周期，结果显示实验组在G0/G1期阻滞，S期细胞数目减低，实验组与对照组、空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)，G2/M期细胞没有显著的变化(P>0.05)，见表1。

表1 siRNA抑制KDR表达对A549细胞周期的影响

注：与空白组、对照组比较，*P<0.05

2.4 干扰KDR后A549细胞对多西他赛的敏感性

经MTT法检测转染pGenesil-1-KDR-siRNA后，A549细胞对不同浓度的多西他赛敏感性均提高。随着药物浓度的增强，多西他赛对A549细胞的抑制率也有增加，呈现出一定的剂量依赖性，实验组A549细胞对不同浓度的多西他赛敏感性明显高于空白组和对照组(P<0.05，表2)。

2.5 对A549细胞集落形成的影响 经平板克隆检测显示，pGenesil-1-KDR-siRNA转染后，A549细胞对不同浓度的多西他赛敏感性均有提高，细胞克隆形成数出现显著的减少，克隆形成抑制率也显著提高(P<0.05)。随着多西他赛药物浓度的增强，其对细胞克隆形成的抑制率也有增加，并且显示出剂量依赖性，实验组A559细胞对不同浓度的多西他赛克隆形成抑制率明显高于空白组和对照组(P<0.05，表2)。

表2 多西他赛对A549细胞增殖及A549细胞克隆形成抑制率

注：与空白组、对照组比较，*P<0.05

3 讨论

随着肺癌发病率的逐年上升、发病年龄的逐渐年轻化，人类健康受到了严重的威胁[10-12]。有研究认为，肿瘤发病主要原因是细胞增殖过度及细胞凋亡受抑制、死亡不足，致使病变组织内肿瘤细胞存活时间延长，细胞群体内存活与死亡的平衡遭到了破坏，出现存活大于死亡、肿瘤细胞数目的净增长加大的不平衡现象[13]，据此想办法阻止肿瘤细胞的增殖就成为了新的一种治疗方向。近些年来，随着人类基因组计划的完成和功能基因科学的快速发展，肿瘤基因方面的治疗得到医学界广泛的重视。肺癌细胞的增殖、侵袭及迁移中涉及众多基因结构和功能异常，明确关键基因对肺癌发病中起的作用,对临床诊断、治疗及预防肺癌意义重大。

RNA干扰技术的快速发展，为肿瘤基因的治疗提供了基础，近年来已成为研究热点[14-16]。研究发现，KDR在细胞生长和分化中起着关键的作用，因为KDR可以自分泌形式直接作用于肿瘤细胞，抑制细胞的增殖，并促进细胞凋亡[17]。本实验基于肿瘤与正常组织中KDR的表达所具有的差异特点，设计并合成KDR-siRNA序列，LipofectamineTM2000转染A549细胞。实验结果表明，在转染细胞24 h后实验组显示出较明显的生长抑制,48 h后呈现明显的抑制作用。

本实验通过小分子KDR干扰RNA采用流式细胞仪检测A549细胞周期，结果显示阻滞在G0/G1期，S期的细胞数目减低，并且有肿瘤生长停滞的现象；多西他赛对沉默KDR后A549细胞的敏感性有显著增强作用，表明KDR被沉默后细胞的分裂增殖可有效降低，并使肺癌细胞对化疗药物的敏感性增强。本实验研究结果表明，小分子KDR干扰RNA沉默KDR基因可有效抑制细胞增殖，并能增强肺癌A549细胞对化疗药物的敏感性，这可为恶性肿瘤的治疗或辅助治疗提供新的思路和研究方向。

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Kinase-domain insert containing receptor gene silencing inhibited proliferation of human lung cancer cell line A549 and enhanced their sensitivity to docetaxel

ZHANGXiuyi

(Department of Respiratory, Chengde Central Hospital, Chengde Hebei 067000, China)

Objective This study investigated the effect of small interfering RNA-mediated kinase-domain insert containing receptor (KDR) knock-down on proliferation of human lung cancer cell line A549 and their sensitivity to docetaxel. Methods The small interfering RNA (siRNA) against KDR was constructed and transfected into A549 cells with LipofectamineTM2000. The expre-ssion of KDR was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction and Western Blot. Flow cytometry was used to detect the cell cycle. Sensitivity to docetaxel after transfection were exa-mined by methyl thiazolyl tetrazolium assay and clonogenic assay. Results In A549 cells， the protein and mRNA levels of KDR were decreased significantly after transfection，and reduction of proli-feration was related to an increase in the fraction of G0/G1 phase. The sensitivity of A549 cells to docetaxel was increased significantly after transfection. Conclusion The KDR special siRNA silenced KDR，decreased A549 cells proliferation and enhanced their sensitivity to docetaxel.

Kinase-domain insert containing receptor (KDR); Small interfering RNA (siRNA); Lung cancer; A549 cells; Cell proliferation; Docetaxel

067000 河北 承德，承德市中心医院呼吸内科(张秀义)

R734.2；R979.1

A

2095-3097(2015)03-0133-05

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.03.002

2014-12-01 本文编辑：徐海琴)