丝孢酵母菌属显色鉴定的研究

廖晚珍，曾令兵，孙爱娣，彭卫华，胡雪飞，胡妮娅

(南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌330006)

近年来，由于广谱抗菌药物、皮质激素、免疫抑制剂等广泛应用，各种侵入性操作的开展，全身和局部抵抗力低下导致免疫损害的患者由阿萨希丝孢酵母菌引起的感染越来越多，而且临床常常难以作出及时、准确的诊断，往往错过最佳的治疗时机，导致很高的死亡率。发生这种情况的主要原因是临床医师和微生物学检验人员对其缺乏认识，而往往存在误检和漏检。对于阿萨希丝孢酵母菌及同属其他种的表型检测，目前医院只能采用BIOMERIEUX VITEK-2-Compact和ATB-ID-32C系统以及API 20C AUX系统，但上述方法不仅受到条件的限制，而且费时、费力、费成本，不适合基层医院的常规检测。因此，寻找一种鉴定时间更短、鉴定成本更低、操作更简便、敏感性和特异性较好的方法，成为当务之急。近几年来，我们对临床分离的阿萨希丝孢酵母菌与标准菌株及同属其他标准菌株以及念珠菌的标准菌株与临床菌株进行了显色鉴定的研究，同时并经菌落与菌体形态、生化特性等确认，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 .1 菌株来源 收集南昌大学第一附属医院2009年1月至2010年11月30日临床分离的阿萨希丝孢酵母菌18株，6株丝孢酵母菌标准菌株(购于 American type culture Collection-ATCC)，即阿萨希丝孢酵母菌(T.asahii，ATCC 90039)；倒卵丝孢酵母菌(T.ovoides，ATCC 90040)；黏质丝孢酵母菌(T.mucoides，ATCC 90046)；暗红或皮瘤或墨(汁)丝孢酵母菌(T.inkin，ATCC 18020)；皮状丝孢酵母菌 (T.cutanceum，ATCC 757)；星状丝孢酵母菌(T.asteroides，ATCC 22432)以及本室保存的念珠菌38株，包括克柔念珠菌 (ATCC 6258)，新型隐球菌(ATCC 32609)，季也蒙念珠菌(ATCC 21500)，葡萄牙念珠菌 (ATCC 34449)，光滑念珠菌(ATCC 22019)，热带念珠菌(ATCC 1463)，白念珠菌(ATCC 90029)等。

1.1 .2显色培养基与仪器 科玛嘉念珠菌显色培养基由河南郑州博赛生物技术股份有限公司提供。丝孢酵母菌与念珠菌鉴定仪器为BIOMERIEUXVITEK-2-Compact。

1.1 .3药敏试验培养基及药敏纸片 真菌药敏琼脂LS 1940A，LOT SHAD-130201。抗菌药片为丹麦ROSCO公司产品，包括两性霉素B(AMPHO、10μg/片)，特比奈芬(TEB、30μg/片)，氟康唑(FLZ、25μg/片)，氟胞嘧啶(FLU、1μg/片)，卡泊芬净(CASP、5μg/片)，沃尔康唑(VOR、1μg/片)，伊曲康唑(ITR、10μg/片)，药片直径9.2mm。

1.2 方法

1.2 .1显色培养 挑取萨布罗琼脂(SDA)T.asahii标准菌株与临床菌株和丝孢酵母菌的其他5个标准菌株以及念珠菌标准菌株与临床菌株的单个菌落密集接种科玛嘉念珠菌显色培养基，置35℃(湿度约50%)空气培养 (丝孢酵母菌加做28℃显色培养)，次日观察并记录结果。

1.2 .2菌落菌体形态检测 挑取T.asahii标准菌株与临床菌株以及丝孢酵母菌的其他5个标准菌株单个菌落点种SDA，置35℃空气培养，每天观察生长情况，并涂片、染色、镜检与拍照等。

1.2 .3生化鉴定 挑取35℃SDA上孵育18~72h的T.asahii标准菌株与临床菌株、T.inkin与T.mucoides标准菌株和念珠菌标准菌株与临床菌株，将菌液浓度调至1.8~2.2MCF，再接种YST卡经BIOMERIEUX-VITEK-2-Compact进行菌株鉴定。1.2.4 药敏检测 调节菌液浓度为5×105CFU/ml，接种前平皿置35℃干燥20min，9cm平皿吸0.5ml接种液，倾注平板表面，均匀涂布，并放置室温干燥10min贴药片(也可按K-B法用棉拭子涂布)。然后置35℃培养18~24h测量抑菌圈。对过夜培养真菌不生长者应延长24h。对多烯类药物和氟胞嘧啶测量时应为清晰的抑菌圈，若抑菌圈内有菌落应视为耐药突变株。对于吡咯类、咪唑类及特比奈芬抑菌圈内的小菌落可不视为突变株。采用白念珠菌(ATCC 90028)、近平滑念珠菌(ATCC 22019)、克柔念珠菌(ATCC 6258)进行质控。

2 结果

2.1 菌落特征

2.1 .1 SDA菌落特征 T.asahii标准菌株与临床菌株以及丝孢酵母菌的其他5个标准菌株在35℃时菌落呈中等速度生长(比念珠菌生长慢)。念珠菌菌落呈灰白色、隆起、细腻、光亮、似奶油状，菌落周边与中央无区别。而T.asahii菌落呈灰色、表面粗糙、边缘菲薄、而且越靠近菌落边缘越薄、颜色越浅，菌落中心为白色，而且越靠近中央颜色越明显，并呈乳头状凸起，且有短小的细绒毛形成(见图1)。随着培养时间延长菌落边缘凸起呈花边状，表面有宽而深的树根状或脑回状裂隙，即带有不规则放射状排列的皱褶(见图2)。T.mucoides菌落潮湿、边缘整齐、毛状不明显、白色、脑回样、隆起并折叠、有的呈钮扣状。而T.inkin菌落局限，即薄而扁、干燥、易推动，白色、细的脑回样覆盖有小颗粒，表面有不规则花边状物凸起，没有边界带，常嵌入琼脂，“花边状物”凸起是该菌最为明显的特征。T.ovoides呈灰白色、菌落明显凸起、边缘不齐、常嵌入琼脂，表面可见细绒毛，菌落周边颜色稍淡。T.cutanceum和T.asteroides，前者与T.asahii基本相似，其最大特点是，菌落与琼脂结合得特别紧密，很难刮取，其它5个标准菌株和T.asahii临床菌株没有此现象，后者与其他种比较无特殊。

2.1 .2 显 色 培 养 基 菌 落 特 征 T.asahii，T.cutanceum，T.inkin，T.ovoides，T.asteroides在念珠菌显色培养基平板的背面明显呈天蓝色 (或称蓝绿色，见图3)，在正面呈灰白色(见图4)，而所有念珠菌、隐球菌、红酵母等不显这种天蓝色，而且正反面显色一致，如热带念珠菌在念珠菌显色培养基

注：T.asahii SDA 2～3d菌落呈灰色、表面粗糙、边缘菲薄、中央显白色、并呈乳头状凸起、且有短小的细绒毛。

图2 T.asahii22℃SDA菌落生长特征

图3 T.asahii在念珠菌显色培养基背面的显色特点

图4 T.asahii在念珠菌显色培养基正面的显色特点

图5 热带念珠菌的显色特点

中显铁蓝色(见图5),这是上述5种丝孢酵母菌与其他酵母(样)真菌的明显不同之处。其次，用接种环或棉拭子等刮去琼脂上的菌落时，培养基仍然存在明显的天蓝色，而念珠菌等没有这种现象，即菌落下面(显色平板表面)不会留下任何颜色，这说明上述5种丝孢酵母菌所产生的色素具有向念珠菌显色培养基中渗透的能力，而念珠菌等没有色素渗透或侵入生长的能力，这种独特的现象又可作为鉴别的一项指标。6个标准菌株中只有T.mucoides不显这种蓝色，但也不显其它颜色，保持其灰色。综上所述，只要在念珠菌显色培养基上显天蓝色的酵母(样)菌即可确定为丝孢酵母菌，且临床标本中，若出现该现象，95%以上可确定为T.asahii。

2.2 光学显微特征 生理盐水涂片时，T.asahii及同属其他种菌很难乳化，菌悬液呈颗粒状，而念珠菌、隐球菌等菌极易乳化，菌悬液均匀。T.asahii镜检时有菌丝、关节孢子和多形态分生孢子。菌丝分隔，大多数不分枝、粗细不一。关节孢子数目不等、长短不一、两端钝圆并呈竹节状。T.mucoides的关节孢子也呈竹节状，但该菌在显色培养基上不显蓝色，此可作为两者的鉴别点。而T.inkin、T.cutanceum，T.ovoides，T.asteroides的关节孢子呈柱状，分生孢子呈圆形或椭圆形，少数呈长方形，出芽或不出芽，可见顶生、间生或游离型厚壁孢子。菌丝和孢子总的来看形态不规则，而念珠菌多数是孢子、少数为菌丝，孢子绝大多数呈圆形或椭圆形，大小基本一致，并可见较多的芽生孢子。

2.3 生化特征18株T.asahii临床菌株与标准菌株其生化鉴定率90%~99%。T.inkin与T.mucoides标准菌株的鉴定率分别为97%与99%。38株显其它颜色的酵母(样)菌鉴定率均大于85%。

2.4 药敏试验结果 采用 TEB、CASP、FLZ、VOR、AMPHO、ITR、FLU药片对丝孢酵母菌6株标准菌株和T.asahii所有临床菌株进行体外敏感性试验，其检测结果是：6株标准菌株和18株临床菌株对VOR、AMPHO均敏感。标准菌株和部分临床菌株对FLZ和ITR敏感，大部分为中介，个别菌株对ITR耐药。除少数标准菌株对TEB敏感外，多数标准菌株和所有临床菌株对TEB均为中介，个别菌株出现耐药。所有丝孢酵母菌标准菌株和不同来源的临床菌株对FLU和CASP均耐药，而T.asahii所有菌株对两性霉素B的活性比较差、且不稳定、波动范围大，MIC值在0.75~>32μg/ml，其中9株>32μg/ml，75%为耐药；2 株 1.0μg/ml，1 株 0.75μg/m l，此结果与扩散法相反。唑类抗真菌药物对T.asahii所有菌株有较好的活性，又以伏立康唑最敏感，MIC值在0.004~0.125μg/ml；伊曲康唑次之，MIC值在0.19~1.50μg/ml；氟康唑的活性要比前2种差，MIC值绝大部分在0.75~3.00μg/ml，还有来自皮肤标本的菌株MIC值在24μg/ml，高出8倍。总的来看，结果与扩散法相似。

3 讨论

丝孢酵母菌属于真菌界、担子菌门(或亚门，或称半知菌门或亚门)、芽生菌纲(或芽胞纲、或银耳纲)、隐球酵母目(或担孢目或银耳目)、皮肤丝孢酵母科(或隐球酵母科)、丝孢酵母属，包括38个种，其中13个种可引起人类感染[2]。最近的系统学研究表明，致病的丝孢酵母菌主要有6个种，即T.asahii、T.asteroides、T.cutanceum、T.inkin、T.mucoides和T.ovoides。其中T.asahii与深部感染有关[3，4]，与我院临床分离的菌株和感染的情况一致。从现有的临床资料看，患者有无免疫功能低下都可感染并引起系统播散，但免疫功能低下患者较免疫正常患者更容易引起感染[5，6]。其原因(可能的发病机制)是，平时宿主局部甚至全身的免疫网络对这些定植的低等真核生物保持制约和监视，将其限制在特定部位并保持较低的载量，一旦免疫系统受损有了机会这些真菌就会启动菌群密度感应信号和菌相转换信号，由母细胞多极出芽繁殖，部分出芽细胞不脱落而不断延长形成菌丝(或假菌丝)，增多的菌体数量和形成的菌丝需要更多的营养及更宽裕的生存空间，因此就会表达毒力基因产生毒力蛋白，黏附并侵袭附近的宿主黏膜上皮细胞，甚至产生易位效应，由肠道或口咽、食管、阴道等黏膜侵入机体，造成播散性感染[7]。近年来感染有增多倾向，主要有以下三个原因：一是T.asahii等的感染确实在增多，尤其是综合性医院，但过去没有引起注意。二是由于抗菌药物在前些年的不合理使用甚至滥用所造成。三是过去无论是临床医生还是微生物学检验人员对此菌缺乏认识，加上检测手段(方法)不多、检测不到位，误检或漏检可能普遍存在。

以往对T.asahii等的鉴定只能依靠VITEK-2-Compact系统和ATB-ID-32C系统以及API 20C AUX系统或分子生物学，其他型别仪器和方法无法检出。采用分子生物学检测T.asahii等(包括测序)，除了需购买一整套试剂外，还需有PCR仪和自动DNA测序仪等高档设备，而医院检验科一般都没有测序仪这种配置。此外，就时间而言，从DNA提取开始到完成测序和比对需要几天的时间，如果DNA测序要外送的话时间就更长。若采用VITEK-2-Compact系统或ATB-ID-32C系统鉴定T.asahii等，一要时间(需等待真菌对糖的发酵，碳、氮源的同化，耐温试验和外源性维生素依赖检测等)，二要有这种设备，而国内目前很大一部分医院包括三级医院不一定有这种配备，由于没有这种功能仪器根本无法检测T.asahii。即使采用相对简单、经济的API 20C AUX系统，也需进口试剂，操作也较繁琐。

1990 年以来一系列商品化显色培养基进入临床微生物实验室出现了针对越来越多的细菌和真菌的显色培养基[8]，其中念珠菌显色培养基就是众多商品化显色培养基的一种。在真菌(指酵母菌)培养基中加入检测某种菌种的特异性酶底物，底物由色基因和微生物可代谢物质组成，通常是无色的，如果标本中(或待测菌培养物)存在该菌及其特有的酶，在酶的作用下产色基因被游离出来，使菌种产生颜色，采用这种方法进行筛选或鉴定，其敏感性和特异性都高。科玛嘉念珠菌显色培养基多用于常见念珠菌菌的鉴定，在培养基上显绿色或翠绿色、蓝灰色或铁蓝色(见图5)、紫色、粉红色的分别是白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌，后两种菌除颜色外还要根据菌落的特点来确定。我们注意到，在此培养基上T.asahii呈天蓝色，与热带念珠菌所显的铁蓝色(实际上更偏重于灰色)和白念珠菌所显的绿色存在明显的差别，两者在色泽上很好区分，不会造成颜色分辨上的困难和鉴别上的麻烦。此外，念珠菌与丝孢酵母菌无论在SDA还是念珠菌显色培养基上菌落的形态也不一样。我们通过在念珠菌显色培养基上对菌落的显色，对T.asahii等进行快速、准确的鉴定，不仅缩短了对丝孢酵母菌的鉴定时间，而且操作简便，敏感性与特异性好，而且涵盖面广 (包括T.asahii、T.cutanceum、T.inkin、T.ovoides、T.asteroides5个种)，不需要昂贵的进口设备、耗材与试剂，检测成本低，而且解决了多年来完全依靠新版API 20C AUX和VITEK-2-Compact系统以及ATB-ID-32C系统表型检测的难题，极大地方便了各级医院的常规检测，这对临床丝孢酵母菌病的及时诊断和患者的早期治疗具有非常重要的意义。根据王端礼的《医学真菌学》，播散性丝孢酵母菌病的临床表现在许多方面与播散性念珠菌病相似，可呈急性或慢性感染过程。因此，诊断与鉴别主要靠真菌学。治疗方面，大多数丝孢酵母菌病患者在抗真菌药物(如：两性霉素B及其脂质体、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、特比奈芬等)治疗的同时，还应对基础性疾病和继发的细菌感染进行治疗，并加强支持疗法(如应用免疫调节剂，提高患者的免疫功能，并注意脏器的保护)。如有肝肾功能情况则改用脂质体两性霉素B联合氟康唑治疗。若有明显肝肾功能损害时，用两性霉素B脂质体，但治疗时间需延长，或单用伏立康唑。非白细胞减少的局限性感染者常用两性霉素B与其他唑类药物联合治疗。白细胞减少者两性霉素B可能疗效欠佳，可采用两性霉素B与氟康唑或伊曲康唑联合治疗有效，也有学者提出，T.asalii感染首选伏立康唑，其次是伊曲康唑、氟康唑、脂质体两性霉素B等，本研究中药敏试验结果与该建议一致。临床在抗感染时应依据药敏结果合理使用抗菌药物。

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