血液肿瘤CD44基因检测及4亚型克隆原核表达

蔡壬辛 ，洪旭灿 ，张轩 ，李沫 ，秦笙 ，许振杰 ，曾建明

(1、广东省中医院检验科，广东 广州 510006；2、佛山市第二人民医院检验科，广州 佛山528000)

CD44是广泛分布于多种细胞表面的糖蛋白分子，属黏附分子的成员，具有多种重要的生物功能，它与细胞黏附、淋巴细胞活化和归巢、肿瘤生长和转移密切相关[1,2]；CD44分子呈广泛多态性，多态性主要由核心肽的不同及翻译后的糖基化修饰引起[3]。目前对CD44分子的研究主要集中在实体瘤，相继发现CD44v6亚型的过度表达与多种人体恶性肿瘤的发生、发展、侵袭和转移密切相关，被认为是肿瘤转移促进因子[4-7]。

化疗后复发是白血病治疗的难点，近十年提出残留的白血病干细胞(leukemia stem cells,LSCs)是疾病复发的根源。有研究提示拮抗LSCs黏附、归巢(homing)途径可能有助于杀灭LSCs[8]。有研究发现CD44单克隆抗体A3D8通过抑制ERK1/2上调Bim诱导HL-60细胞早期凋亡[9]。CD44通过p27Kip1途径抑制AML细胞增殖[10]。伊马替尼是治疗慢性粒细胞白血病(CML)的一线药物，它能够降低JURL-MK1细胞CD44等分子表达，并引起细胞凋亡[11]；现发现伊马替尼耐药细胞中CD44亦表达增高[12]，阻断CD44有益于CML患者自体移植[13,14]。另外，CD44在AML和CML的LSCs细胞龛中发挥重要作用[15]。此外，淋巴瘤CD44高表达患者发生治疗不缓解或复发，甚至死亡率更高[16]；小鼠动物实验也发现BCR-ABL1转染的CD44缺陷干细胞不能在受体小鼠骨髓归巢[13]，这提示通过干预CD44途径实现拮抗残留的LSCs，有望成为白血病治疗新的切入点。

本实验旨在通过PCR检测临床血液肿瘤患者和细胞株CD44分子，并通过基因重组技术构建CD44胞外区(hCD44om)多肽原核表达载体，在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达，为下一步研究CD44骨髓靶向功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 .1 主要试剂 X-gal、IPTG、 氨苄西林钠(Amp)、低分子质量蛋白标准、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，购自大连宝生物工程有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨、低熔点琼脂糖，购自北京原平皓生物工程公司；限制性内切酶EcoR I、HindⅢ，连接酶，Ex TaqDNA聚合酶为 TakaRa公司产品；Trizol、DNA Marker、质粒抽提和胶回收试剂盒为东盛公司产品，蛋白Marker、异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)为Fermentas公司产品；ECL超敏发光液为北京普利莱公司产品，兔抗人CD44单克隆抗体为美国Abcam公司产品，羊抗兔IgG-HRP为武汉博士德公司产品。

1.1 .2标本 血标本源于广东省中医院临床样本。9个标本中，4例为急性白血病(AML)，5例为慢性粒细胞白细胞 (CML)；K562、HL-60细胞源于南方医科大学附属南方医院血液科实验室。

1.1 .3 菌种和质粒 质粒pET32a(+)、大肠埃希菌(E.coli)DH5α为本实验室保存，BL21(DE3)由东盛生物公司提供。

1.1 .4 PCR引物 根据Genbank基因序列设计引物，由北京华大基因技术有限公司合成。P1：5’-CCGGAATTCATGGACAAGTTTTGGTGGCACG-3’(含 EcoR I 酶切位点)；P2：5’-CGCAAGCTTTTCTGGAATTTGGGGTGTCCT-3’(含 HindⅢ 酶切位点)。

1.2 方法

1.2 .1 cDNA的制备 采用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，Trizol提取总RNA，-70℃保存备用。参照Invitrogen公司试剂盒（货号1559026）说明书提取细胞总RNA，按TakaRa试剂盒说明书进行 RT-PCR。 PCR 条件：95℃预变性 5 min；94℃45s、55℃ 40s、72℃延伸 1min，共 30 个循环；72℃延伸10min。

1.2 .2重组质粒pET32-CD44的构建 凝胶回收试剂盒回收PCR产物，经EcoR I、HindⅢ双酶切后与同样双酶切的 pET32a(+)质粒 16℃连接3h，转化DH5α感受态细胞，涂布于60μg/ml Amp LB平板，培养10～14h后挑选单个菌落，转移至3ml 60μg/m l Amp LB培养，37℃ 250r/min摇菌培养10~14h，菌液煮沸后PCR鉴定；同时送Invitrogen公司测序鉴定。

1.2 .3 CD44胞外区的诱导表达 将测序鉴定正确的重组表达载体pET32-CD44转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单个克隆于含60μg/m l Amp LB液体培养基中过夜培养。取60μl过夜培养液菌至3ml 60μg/ml Amp LB，培养至A600值为0.6~0.8时，加入终浓度为 0.2、0.4、0.6和 1.0 mM 的 IPTG，37℃振荡培养 4h，4℃离心收集菌体，10%SDSPAGE分析；然后以终浓度为1.0 mM的IPTG在37℃诱导2h~5h，再进行SDS-PAGE分析；同时进行30℃诱导表达。以BandScan5.0软件分析蛋白表达情况。按优化后条件扩大培养，分别取上清及包涵体沉淀进行SDS-PAGE分析蛋白表达情况。以pET28a(+)-GFP为阳性对照，BL21(DE3)菌为阴性对照。

1.2 .4 Western blot细菌裂解产物离心后经10%SDS-PAGE电泳，湿转PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1h后，与兔抗人CD44单克隆抗体(1:5000)37℃孵育 2h；1×TBS-T(1×TBS，0.05 Tween 20)充分洗涤，然后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(1:3000)37℃孵育2h；洗膜后用加入ECL发光液浸泡2min，暗室显影、定影。

2 结果

2.1 CD44基因检测 除K562细胞组扩增结果为阴性外，9例临床标本和HL-60细胞的PCR产物电泳均获得特异性电泳条带(结果未展示)。PCR结果测序后经DNAman软件比对分析，发现HL-60 CD44与9例临床标本序列差异较大，其与参考序列比对发现其匹配度为 83.83%(见图1)；再以BLASTX程序比对nr蛋白库，发现HL-60细胞与CD44isoform4型一致性最高，但第21位出现4个氨基酸HPHQ(H:组氨酸,P:脯氨酸,Q:谷氨酰胺)，160~213氨基酸出现较高频率的点突变；其余标本为CD44isoform4型(NP_001001391.1)。比对结果见图2。

图1 HL-60细胞CD44测序部分结果

图2 HL-60细胞CD44测序结果的BLASTX比对分析

2.2 pET32-CD44鉴定结果 PCR鉴定pET32-CD44转化子，1%琼脂糖凝胶电泳见DNA条带位置与预计的产物804bp一致 (图3)；测序结果与Genbank序列比对完全一致，部分峰型图结果见图4。

图3 pET32-CD44质粒鉴定图

图4 pET32-CD44质粒部分测序结果

2.3 CD44胞外区诱导表达条件的优化 pET32-CD44转化BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达。CD44的优化表达结果，各温度、各时间点表达产物进行10%SDS-PAGE电泳(图5)。与不含质粒BL21(DE3)相比在53KD处出现一条蛋白表达条带，片段大小与预期值相符。用BandScan5.0软件分析发现，IPTG浓度对目的蛋白表达量影响不大 (图5A)，1 mM IPTG，37℃诱导2h的表达量最大，占总蛋白的48.6%。

2.4 CD44的表达形式分析 诱导表达产物的10%SDS-PAGE结果见图6。BandScan5.0分析hCD44om在2h细菌裂解液的沉淀中占总蛋白的37.3%，在上清中占总蛋白的14.2%；在3h细菌裂解液的沉淀中占总蛋白的23.8%，在上清中占总蛋白的21.8%，表明该蛋白在菌体中同时有包涵体和可溶表达两种形式，随着诱导时间不同，蛋白存在形式发生改变。

图5 蛋白表达产物10%SDS-PAGE结果

图6 SDS-PAGE分析蛋白表达形式

2.5 Western blot鉴定 1mM IPTG 37℃诱导2h细菌裂解沉淀经SDS-PAGE电泳后转膜后以兔抗人CD44单克隆抗体(1:5000)为一抗，进行ECL显影(图7)，结果发现在53KD处出现特异性条带，且显色条带随蛋白加入量增加而增强。

图7 Western blot分析人CD44蛋白特异性

3 讨论

近年来在研究CD44基因及蛋白结构和生物学功能的基础上，对其在肿瘤发生、发展、转移中的机制进行了大量探索[17]，对肿瘤干细胞的表型研究亦发现CD44为多种肿瘤干细胞的细胞表面标记物，因此针对CD44的靶向治疗可能揭示分子靶点治疗的新前景。

CD44基因含20个外显子(exon)，其中exon1~5，exon16~20为组成型表达，中间的exon6~15则为可变表达，因此命名为v1~v10[18]。CD44v转录方式十分复杂，其中，CD44v6亚型高表达与实体肿瘤转移、侵袭密切相关；而CD44v在血液肿瘤中的研究尚不够清楚。

本实验基于CD44基因剪切模式研究进展，设计上游引物位于exon1上，下游引物跨exon16、exon17a，因此，理论上可以检测到不同的CD44v亚型。测序结果显示AML、CML临床标本均为CD44isoform4 型 (图 1)，HL-60 为 CD44isoform4 变异性，且有多个氨基酸发生突变。估计与细胞株基因组不稳定有关。此外，未能在K562细胞株中检出CD44(重复3次)，与文献报道不一致，原因不明[14,19,20]。

在蛋白表达方面，试验发现pET32a/BL21(DE3)原核表达系统不能够表达CD44全长蛋白(其编码区CDS插入到pET32a(+)的EcoR I和HindⅢ酶切位点之间，数据未显示)，而重新设计引物克隆无信号肽的CD44胞外区则可以被IPTG高效诱导表达。在课题组前期进行的CD96蛋白的表达中也观察到类似的情况[21]，估计这与CD44信号肽和跨膜区氨基酸极性有关。本文对蛋白原核表达所用IPTG浓度、温度和诱导时间进行优化，发现IPTG浓度对CD44表达量影响不大，37℃结果略高于30℃，2~3h时达到较高的表达水平，这与CD96蛋白诱导条件不同[21]。

试验发现CD44在细菌裂解液沉淀和上清中含量在不断变化，表明该蛋白以包涵体和可溶性形式表达，同时随着诱导时间延长，蛋白存在的形式也发生改变。此外，Western blot分析发现：CD44单克隆抗体在53KD处有条带，在53KD条带下还有小的拖尾带，可能是目的蛋白降解所致。

综上所述，本实验发现AML和CML患者外周血细胞表达CD44isoform4型分子，HL-60细胞为CD44isoform4变异性，K562细胞中不表达CD44，为后续研究CD44在髓系白血病中的作用奠定基础；同时，实验获得CD44isoform4胞外区片段，为进一步研究单克隆抗体制备提供了基础。

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