水溶性富勒烯衍生物抗氧化特性的研究进展

窦 晓，马莹莹，王成端，马冬梅，杨建刚

（1．四川理工学院，四川 自贡643000；2．四川文理学院，四川 达州635000）

富勒烯是完全由碳组成的中空的球形、椭球形、柱形或管状分子的总称。富勒烯因其表面有大量易与自由基反应的共价双键而被誉为“吸收自由基的海绵”［1－2］。因此，它可以作为体内自由基的清除剂和抗氧化剂，在生物医学和药物化学领域展现出极高的潜在价值。在体内，含有活性氧的羟基自由基、过氧化物自由基和超氧化物阴离子被公认为是造成细胞死亡的重要原因，同时也是引起慢性神经变性疾病（如肌萎缩侧索硬化症、慢性阿尔茨海默病和帕金森病）的主要因素。利用富勒烯可消除体内的含活性氧的自由基［3］。一般来说，富勒烯在消除活性氧时存在两种不同的作用机制：一种是富勒烯分子表面吸附一定量的活性氧，经过一系列化学反应使得表面的活性氧催化分解，从而重新得到富勒烯；第二种是通过富勒烯和自由基团之间进行电子传递过程中发生氧化还原作用来进行的。

然而富勒烯本身不溶于水，为了使其能被人体所利用，必须对富勒烯分子进行改造使其具有水溶性。科学家为此做了大量研究并得到了多种水溶性富勒烯衍生物，有很多在细胞抗氧化和保护机制中起到了理想效果。作者概述了水溶性富勒烯衍生物的最新研究进展及其作为抗氧化和细胞保护药物的潜在应用价值。

1 水溶性富勒烯衍生物的合成

一般来说，可以通过以下4种方法得到水溶性富勒烯：（1）将富勒烯封闭在亲水性寄主物质（如环糊精、杯芳烃等）的内部疏水空间中［4－7］；（2）将富勒烯及其衍生物的超分子结构或共价基团加入到水溶性高分子聚合物或者生物大分子蛋白质中［8］；（3）用适宜的表面活性剂使富勒烯悬浮在水溶液中；（4）直接通过加成反应使富勒烯获得亲水活性。

从药理角度来看，前两种方法存在一些问题：（1）基于富勒烯构造成的高分子体系在溶剂中的确切结构还不清楚；（2）很难获得这些高分子材料的均匀样品；（3）在许多情况下成功嵌合上的富勒烯分子的数量无法计算。而第3种方法是将富勒烯溶于它的良溶剂四氢呋喃、甲苯中，然后与水混合，除去有机溶剂得到5～200nm的纳米颗粒水悬液。第4种方法是目前研究最多的，人们通过加成反应合成了大量的能溶于非芳香族溶剂和水的功能性富勒烯。其中两种最为常用的方法是丙二酸酯环丙烷的亲核加成和富勒烯吡咯烷的构成反应［9－10］。丙二酸酯环丙烷的亲核加成是利用丙二酸酯与1，3－二羰基相关的化合物的加成使富勒烯环丙烷化，这个过程称为宾格尔反应，是富勒烯环丙烷化的主要途径。马冬梅等［11］概述了［60］富勒烯的三元环化衍生物的功能化和其三元环化反应的发生机理。利用这种方法得到的三重加合物具有很好的水溶性和生物活性，但多重加成功能化的一个缺点就是随着加合物数量的增加，对富勒烯球体系统的破坏也会增大。因为随着加合物数量的不断增加，富勒烯分子的电荷量和亲核能力会变得越来越低，直接导致其抗氧化和细胞保护活性的不断降低［3］。富勒烯吡咯烷的构成反应是将原位生成的甲亚胺叶立德的1，3－偶极环加成到C60上，从而得到吡咯烷富勒烯。进一步的官能化反应是通过适当醛的甲亚胺叶立德形成或者吡咯烷氮原子的季胺化反应实现。康峰等［12］利用这种方法合成了2种富勒烯吡咯烷中间体。

近年来，除丙二酸酯加合物和富勒烯吡咯烷之外，还合成了许多不同的水溶性富勒烯衍生物，它们的合成方式和上述两种方法完全不同。这些研究很大程度上丰富了潜在有效抗氧化物的数量，也加强了富勒烯的电子结构对其生物医学和药理活性的影响的认识。

2 水溶性富勒烯对活性氧的淬灭活性

普遍认为，超氧化物阴离子是神经元变性的罪魁祸首，同时也是活性氧毒性的主要物质［13－15］。另外，一些含有羟基和一氧化碳自由基的小分子也是触发人和动物体内的氧化应激反应的主要角色。为了确定富勒烯是否可以淬灭活性氧以及获得其可能存在的构效关系，科学家们对一些水溶性的富勒烯衍生物进行了标准化实验，以此评估它们对活性氧物质的自由基的淬灭活性。

2．1 对超氧化物的淬灭活性

氧化性损伤是引起中枢神经系统退行性疾病的主要原因，人们很想得到一种可以保护细胞免受氧化性损伤的药物。为了筛选可能的细胞保护药物，人们设计了各种各样的标准化测试系统，这些系统大多数是基于体内的由黄嘌呤或者黄嘌呤氧化酶产生的超氧化物来设计的。McCord等［16］发现超氧化物的分解也许可以通过光度法测量细胞色素C的减少来完成。

富勒醇和六磺丁基富勒烯是最早进行超氧化物清除活性检测的水溶性富勒烯衍生物［17－20］，它们有很好的清除活性，50μmol·L－1和100μmol·L－1浓度的六磺丁基富勒烯对超氧化物的抑制效率分别达到60%和90%，而含有羟基官能团的富勒醇在1mmol·L－1浓度下却只有40%的抑制效率。这可能是由于，富勒醇对富勒烯球体结构破坏得更严重，致使富勒烯表面官能化程度更大。因此，可以推测衍生物对富勒烯结构影响越小，其抗氧化活性就越强。与此同时，由丙二酸与富勒烯核心相连接形成的羧基富勒烯也被检测到具有抗氧化活性。这类羧基富勒烯的出现使得对丙二酸的数量和在富勒烯分子上的球体布局的控制成为可能。孙涛等［21］合成了一种C60－低聚壳聚糖衍生物，具有良好的超氧阴离子清除能力、羟基自由基清除能力、还原能力和金属螯合能力。杨新林等［22］制备了一种二加成亚甲基［60］富勒烯膦酸酯衍生物的纳米颗粒水悬液，它对超氧阴离子的清除率达到91．96%。

关于富勒烯的结构功能关系，一般来说，带有负电荷的单加合物是最好的抗氧化物质，这是因为它们拥有更完整的球体结构、更低的还原电位、更高的亲和性。而富勒烯的聚集会降低活性富勒烯在溶液中的浓度，与单体相比其淬灭活性也会减弱。比较未经改造的和经过改造的衍生物发现，前者的亲水性基团和亲脂性部分体积更小，所带的静电荷也更少。在极性溶剂二甲基亚砜中，拥有不同本质特征结构的未经改造的单体可能会形成更大的超分子结构，富勒烯的有效利用率会更低［3］。这些或许可以解释两者的超氧化物淬灭活性的差异。在富勒烯表面添加疏水的加合物基团，它的球体结构发生改变，使得其内在电子和淬灭活性都会减弱。

以上间接实验的多变量是很难控制的，结果分析也有一定的局限性：人工合成的生物化合物（如酶、细胞色素C）在实验中可能造成数据并不准确，另外富勒烯分子间的聚集造成的基质效应和别的一些因素等。尤其是利用细胞色素C来构建负离子富勒烯分子复体时，它的测量活性会被不利的副产物严重干扰。为了掌握富勒烯衍生物更多的动态数据以及更深入地对其淬灭机制进行研究，人们必须对富勒烯衍生物的抗氧化特性及其对超氧化物阴离子的反应进行更进一步的研究。

2．2 对其它活性氧的淬灭活性

在哺乳动物和人体内，除了超氧化物外还有其它小的氧自由基（如羟基自由基或者含氮的氧化自由基）也可能诱导氧化应激反应。有研究者指出，在生理条件下富勒烯对羟基自由基有非常好的清除作用，并且在大多数情况下比清除超氧化物阴离子的活性高出两个数量级。这可能归功于聚羟基化加合物的有效构建［23－29］。富勒醇和一些丙二酸加合物也被报道可以清除含氮的氧化自由基［30］，这表明以富勒烯为基础的材料通过不同的作用机制来影响自身的抗氧化和神经保护活性，也极大地提高了这类物质的潜在医学应用价值。

3 水溶性富勒烯衍生物对体内细胞的保护作用

人们最先是在体外研究中发现许多对活性氧有着较高淬灭活性的富勒烯衍生物，然后选用适当的哺乳动物进行体内研究，从而评估以富勒烯为基础的药物体系在活的组织中的潜在活性氧淬灭作用。已有富勒醇在一些动物模型中清除自由基活性的报道，其中六磺丁基富勒烯在抵抗大脑缺血病灶时展现出良好的神经细胞保护作用。一种树枝状富勒烯衍生物在斑马鱼胚胎中的抗辐射作用与FDA认证的抗辐射药物氨磷汀的效果相当。另外，具有肝脏保护作用的C60原液的悬浮液对四氯化碳毒性很敏感。周强等［31］研究表明，C60－氮芥较氮芥对动物正常器官的氧化损伤和辐射损伤具有保护作用；刘清［32］用0．7mg·mL－1富勒醇作用于10g·L－1D－半乳糖衰老脾细胞模型，证明了富勒醇可以降低衰老脾细胞的死亡率，并通过微量丙二醛试剂盒检测出富勒醇能够减少脾细胞内有害物质的生成从而保护脾细胞；陈田［33］合成了一种富勒烯－蛋氨酸衍生物FMD，研究表明其具有很好的自由基清除能力以及对H2O2诱导的PC12细胞损伤具有保护作用。

Dugan等［34］研究发现，通过系统施用一种富勒烯衍生物可延缓患有家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化症小鼠的神经元的衰退和死亡以及延长SOD2基因剔除的、缺乏线粒体锰超氧化物歧化酶的小鼠的寿命；Beuerle等［3］对富勒烯的一系列衍生物进行实验比较，发现这些物质具有保护斑马鱼中枢神经系统、延缓胚胎细胞凋亡等作用；胡凯骞等［35］研究了功能化富勒烯衍生物在抗氧化应激条件下延长线虫寿命的生物学效应，并推测出Daf－16等应激相关的基因可能是功能化富勒烯衍生物潜在的分子靶点；另外，Lin等［36］对于阻止小鼠大脑中由铁诱导的氧化应激反应也做了研究。

4 水溶性富勒烯衍生物的毒性

为了检验实验的富勒烯的生物相容性，Beuerle等［3］对斑马鱼胚胎中的一切毒性物质进行测定，并进行身体形态学检查，还通过光学显微镜对它的内部器官进行检查，并获得了这些实验的富勒烯的半数致死浓度（LC50）。发现在少数情况下，高剂量的水溶性富勒烯会引起身体的反常变化，比如体长的缩短和不正常的身体弯曲；在某些情况下还会出现心脏的微变、肝脏和肠道的变大或未发育健全，而水溶性富勒烯在其中的浓度都接近LC50。这些结果表明，阴离子富勒烯衍生物一般是没有毒性的，但是高浓度可能会产生畸变效应。一般来说，适宜浓度的水溶性富勒烯在动物体内几乎没有毒性［3］。沈方臻等［37］研究表明，富勒醇对小鼠移植性肝癌生长的抑制作用明显；朱小山等［38］研究发现，C60、nC60的制备过程以及nC60本身的结构均能影响其潜在生物毒性。因此，若制备和设计富勒烯衍生物的方法得当，它们对人体几乎是没有毒性的。

5 展望

近些年，为了让富勒烯及其衍生物从单纯的学术研究发展到商业应用，对富勒烯的研究更多地转入设计和优化它的分子结构领域。目前，已经合成出大量的水溶性富勒烯衍生物，它们结构多样，特点迥异；并且可以通过结构的微调实现不同属性，比如带电性、聚集行为、亲水亲脂平衡性、电子结构、氧化还原活性等。通过对这些内在属性的特殊调整可以得到专业应用的新材料和新化合物。

人们对许多以富勒烯为基础的水溶性富勒烯衍生物的体内外的抗氧化活性和在药理学应用中作为潜在的神经保护药物进行了研究和评估。这些新型的富勒烯衍生物在抵御人类和哺乳动物体内最主要的氧化激发物质活性氧时，大多都表现出很好的淬灭活性。富勒烯衍生物是通过多种作用途径来保护活体系统抵御氧化激发反应的。尽管大量的证据显示富勒烯衍生物的抗氧化性与其相关结构有着密切联系，但其淬灭自由基和神经保护的确切机制仍不明了，还需用更精确的模型系统进行评估。

在不久的将来，对新的水溶性富勒烯衍生物的设计和合成可能会更集中在它特殊的抗氧化性和细胞保护活性方面。而各种富勒烯的抗氧化性和它们的细胞保护活性之间的联系还不清楚。因此，对其化学特性的研究仍然是一项十分艰巨的任务。

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