一株石油烃降解菌的固定化及其降解特性研究

一株石油烃降解菌的固定化及其降解特性研究

卢方斌，李荣超，张蕾，王君

(滨州学院生命科学系，山东 滨州 256600)

摘要：从石油污染盐渍土壤中筛选出一株对液蜡乳化效果明显、对原油降解率达56.8%的菌株，命名为BZ-L。经生理生化和16S rRNA序列分析，初步鉴定该菌株属于沙雷氏菌属。以海藻酸钠和活性炭为包埋剂，对该菌株进行固定化研究。结果表明，当活性炭含量为0.8%时，固定化微球的破损率最低、渗透性最好；在接种量为35.0 g·L-1、NaCl浓度为6.0%时，固定化微球对原油的降解率可达61.7%；菌株BZ-L的固定化微球对原油的降解率明显高于游离菌，且比游离菌的耐盐性能更强，可用于石油污染盐渍土壤的生物修复。

关键词：石油烃降解菌；固定化微球；降解特性；耐盐

基金项目：国家级大学生创新创业训练计划(201310449146),山东省科学技术发展计划资助项目(2011YD21005)

收稿日期：2015-06-02

作者简介：卢方斌(1993-)，男，山东济宁人，研究方向：微生物修复研究，E-mail:mxzlushang@126.com；通讯作者：王君，副教授，E-mail：ivywangjun@163.com。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2015.11.013

中图分类号：X 172文献标识码：A

在石油污染土壤或水体的修复技术中，微生物修复技术因安全、高效、不产生二次污染等优点成为人们处置石油污染的重要手段[1-3]。土壤中的某些土著微生物可以降解原油，但由于单位菌浓度较低或受环境因素的影响，并不能很好地降解原油。固定化微生物技术是一种高效、可重复、不产生二次污染的治理技术，具有微生物单位密度大、微生物流失少、抗外界胁迫能力强、产物易分离、反应过程易控制的优点[4-6]。

关于石油降解菌的固定化技术已有报道，固定化手段和材料丰富多样[7-9]。关晓燕等[10]报道了以聚氨酯泡沫为载体制备固定化菌的研究，在120 h内该菌株对柴油的降解率达85%；单海霞等[11]以硅藻土/活性炭作为降解菌群的固定化载体，对最佳固定化条件进行研究，其固定化菌群对柴油的平均降解率达65%。作者从黄河三角洲地区石油污染盐渍土壤中分离筛选出一株耐盐降解烃的菌株，采用包埋法对该菌株进行了固定化研究，并测定了固定化微球对原油的降解效果和耐盐程度。

1实验

1.1　材料和培养基

土壤样品采自黄河三角洲滨州石油开采区；原油来自胜利油田孤东采油厂。

无机盐培养基(g·L-1)：(NH4)2SO44，NaH2PO41.5，K2HPO43.48，MgSO40.7。自然pH值，121 ℃灭菌30 min。

富集培养基：在无机盐培养基中添加液蜡2%(v/v)。

降解培养基：在无机盐培养基中添加原油0.5%(w/v)。

牛肉膏蛋白胨培养基(g·L-1)：牛肉膏3，蛋白胨5，NaCl 5。pH值7.2，121 ℃灭菌30 min。

1.2　石油降解菌的富集和分离纯化

将2 g土壤样品加入200 mL富集培养基中，160 r·min-1、37 ℃下振荡培养5 d后，以10%接种量转接至新的富集培养基中培养，连续转接培养数次。将富集培养液进行梯度稀释，涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养，挑取单菌落分别接种至富集培养基中，选取对液蜡乳化良好的菌株进行下一步研究。

1.3　菌种的鉴定

1.3.1生理生化特征鉴定

菌株的生理生化特征鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》[12]。

1.3.2菌株的16S rRNA分析

用试剂盒提取已筛选菌的DNA，利用细菌16S rRNA基因通用引物27F和1492R扩增基因序列[13]。PCR反应体系的反应条件为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环;72 ℃延伸10 min。扩增产物经电泳检测后送北京三博远志公司测序，测序结果在NCBI网站进行BLAST比对。利用Clustal 2.0和Mega 4.1软件构建系统发育树。

1.4　固定化菌株的构建

1.4.1细胞悬液的制备

将得到的石油降解菌株接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 ℃恒温摇床振荡培养18 h，培养液于8 000 r·min-1离心5 min，沉淀加入无菌水重悬，使菌悬液中的细胞浓度为1.2×108个·mL-1，保存备用。

1.4.2固定化微球的制备

采用注射器滴落法制备固定化微球[14]。称取0.7 g海藻酸钠放入50 mL的烧杯中，加入10 mL水后用酒精灯加热，边加热边搅拌至海藻酸钠完全溶化，用蒸馏水定容至10 mL。将溶化好的海藻酸钠溶液冷却到室温，加入已制备好的细胞悬液和终含量分别为0.0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的活性炭粉末，充分搅拌使其混合均匀，再转移至注射器中，以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到浓度为0.05 mol·L-1的CaCl2溶液中(CaCl2溶液需提前放入冰槽内)。反应完成后将固定化微球取出，用生理盐水洗涤，备用。

1.5　固定化微球物理性能的测定

1.5.1固定化微球的破损率

随机取活性炭含量分别为0.0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的固定化微球各50颗，放入装有100 mL蒸馏水的250 mL锥形瓶中，置于37 ℃、160 r·min-1恒温摇床中振荡72 h，记录微球的破碎颗数并计算破损率。

1.5.2固定化微球的渗透性

随机取活性炭含量分别为0.0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%的固定化微球浸入墨水中，每隔 4 min 取球剖开，直到微球被墨水完全渗透为止[15]，记录所需的时间。

1.6　固定化微球对原油的降解

1.6.1接种量对原油降解率的影响

分别向降解培养基中接种5.0 g·L-1、15.0 g·L-1、25.0 g·L-1、30.0 g·L-1、35.0 g·L-1、40.0 g·L-1的固定化微球，在37 ℃下振荡培养10 d，测定原油降解率。

1.6.2固定化微球对NaCl的耐受性

配制NaCl浓度分别为0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、10.0%、15.0%的降解培养基，以35.0 g·L-1的接种量加入固定化微球，37 ℃下振荡培养10 d，测定原油降解率，以游离菌株作为对照。

1.7　原油降解率的测定

由于固定化载体材料表面会吸附原油，简单的萃取并不能将原油全部萃出。首先向原油培养基中加入50 mL正己烷，用胶塞紧塞瓶口，充分振荡，萃取培养液中残留原油，然后把固定化微球取出，用正己烷作溶剂进行索氏抽提，最后合并两部分含油溶液，用紫外分光光度法测定原油降解率[16]。

2结果与讨论

2.1　菌种的筛选及分离

经富集培养，从石油污染盐渍土壤中筛选得到一株石油烃降解菌，命名为BZ-L。该菌株对液蜡具有明显的乳化效果(图1)，且在NaCl浓度为4.0%时，对原油的降解率达到56.8%。

A.实验组　B.对照组 图1　菌株BZ-L对液蜡的乳化 Fig.1　Emulsification of liquid paraffin by strain BZ-L

2.2　菌株BZ-L的分类鉴定

将菌株BZ-L接种在牛肉膏蛋白胨固体平板上，37 ℃下培养48 h，菌落呈橘红色，圆形，边缘整齐，表面光滑不透明，易挑取；革兰氏染色为阴性，菌体呈短杆状，两端钝圆。该菌株可利用葡萄糖、蔗糖、D-果糖发酵产酸，不能利用D-阿拉伯糖、D-木糖发酵产酸；不能利用尿素、精氨酸产生硫化氢；甲基红、丙二酸、明胶、酯酶、柠檬酸盐、赖氨酸脱氢酶、鸟氨酸脱氢酶、V-P反应均为阳性。

将扩增得到的 16S rRNA 基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现菌株 BZ-L跟粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)的同源性最近，相似度达99%。采用Clustal 2.0和Mega 4.1软件构建系统发育树，见图2。

图2　菌株BZ-L与相关菌株的系统发育树 Fig.2　Phylogenetic trees of BZ-L and related strains

根据生理生化特征和16S rRNA序列分析，初步鉴定菌株BZ-L属于沙雷氏菌属。

2.3　固定化微球物理性能的测定

2.3.1固定化微球的破损率(图3)

图3　活性炭含量对固定化微球破损率的影响 Fig.3　The effect of content of activated carbon on damage rate of immobilized microspheres

由图3可知，当活性炭含量在0.0%~0.8%之间时，固定化微球的破损率随着活性炭含量的增加而下降，这是由于活性炭可以提升固定化微球的韧性；而当活性炭含量大于0.8%后，微球的破损率上升，可能是由于活性炭的过多加入导致固定化微球空隙过大、松散。

2.3.2固定化微球的渗透性(图4)

图4　活性炭含量对固定化微球渗透性的影响 Fig.4　The effect of content of activated carbon on permeability of immobilized microspheres

由图4可知，当活性炭含量为0.8%时，固定化微球的渗透时间为16 min；再增加活性炭含量，固定化微球的渗透时间几乎保持不变。因此，选取固定化微球中活性炭含量为0.8%。

2.4　固定化微球对原油的降解特性

2.4.1接种量对原油降解率的影响(图5)

图5　接种量对原油降解率的影响 Fig.5　The effect of inoculation amount on degradation rate of crude oil

由图5可知，随着接种量的增大，固定化微球对原油的降解率不断升高；当接种量达到35.0 g·L-1时，

固定化微球对原油的降解率达到58.3%；再增大接种量，固定化微球对原油的降解率反而下降。

2.4.2固定化微球对NaCl的耐受性(图6)

图6　固定化微球和游离菌在不同NaCl浓度下对原油的降解率 Fig.6　Degradation rates of crude oil by immobilized microspheres and free strains in presence of different concentrations of NaCl

由图6可知，固定化微球在NaCl浓度为6.0%时，对原油的降解率最高，达到61.7%；而游离菌在NaCl浓度为4.0%时，对原油的降解率最高，为56.8%；当NaCl浓度高达10.0%以上时，游离菌和固定化微球都对原油有一定的降解，并且在相同NaCl浓度下，固定化微球对原油的降解效果明显好于游离菌。

3结论

从黄河三角洲石油污染的盐渍土壤中分离得到一株石油烃降解菌BZ-L，初步鉴定为沙雷氏菌属。用海藻酸钠和活性炭对该菌进行固定化，在活性炭含量为0.8%的条件下，固定化微球的破损率较低，并具有良好的渗透性。以35.0 g·L-1接种量接种至降解培养基中，发现该固定化微球对原油的降解率比游离菌有显著提高，达到61.7%，对NaCl的耐受性提高到6.0%。菌株BZ-L及其固定化微球在石油污染土壤的生物修复中有良好的应用前景[17]。

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Immobilization and Degradation Characteristics of A Petroleum-Degrading Strain

LU Fang-bin，LI Rong-chao，ZHANG Lei,WANG Jun

(DepartmentofLifeSciences，BinzhouUniversity，Binzhou256600，China)

Abstract：A petroleum-degrading strain named as BZ-L was isolated from the petroleum contaminated saline soil，which could emulsify liquid paraffin well and degradation rate of petroleum was 56.8%.The strain was belonged to Serratia marcescens，according to physical and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence analysis.Sodium alginate and activated carbon were employed as embedding agents to study the immobilization of the strain.Results showed that damage rate of the immobilized microspheres were the lowest and the permeability was the best when content of activated carbon was 0.8%.The degradation rate of petroleum by the immobilized microspheres was 61.7%，with the inoculation amount of 35.0 g·L-1 and the NaCl concentration of 6.0%.The degradation rate of petroleum by the immobilized microspheres was higher than that of the free strain，and they were more halotolerant.Strain BZ-L and the immobilized microspheres could be used in the bioremediation of the petroleum contaminated saline soil.

Keywords：petroleum-degrading strain;immobilized microspheres;degradation characteristics;halotolerant