一株耐盐耐氧反硝化菌MCW148的分离鉴定及其脱氮特性

姜天翔++任华峰++陈进斌++苗英霞++邱金泉++王静

摘要：从渤海某海水养殖场（北美白对虾）底泥中分离到1株耐盐高效好氧反硝化细菌MCW148，经过对其形态特征、生理生化以及16S rDNA序列分析，将该菌株初步鉴定为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。进一步研究表明，菌株MCW148的最适碳源为葡萄糖，最适培养温度为35 ℃，最适pH为6。在最适条件下，菌株MCW148在12 h对NO3--N的去除率为62.4%。

关键词：好氧反硝化菌；巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；脱氮；耐盐

中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）13-2442-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.13.011

Isolation and Identification of a Salt-tolerant and Aerobic Denitrification Bacterial Strain MCW148 and Its Denitrification Characterization

JIANG Tian-xiang， REN Hua-feng， CHEN Jin-bin， MIAO Ying-xia， QIU Jin-quan， WANG Jing

（The Institute of Seawater Desalination and Multipurpose Utilization， State Oceanic Administratrion，

Peoples Republic of China， Tianjin 300192， China）

Abstract： A aerobic denitrification bacterial strain MCW148 with salt-tolerance and high denitrification ability was isolated from sediment of shrimp pond in the Bohai Sea. Results indicated this strain was identified as Bacillus megaterium according to its morphology， biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis. Further study indicated the optimal carbon was glucose， and the optimal pH and temperature for cell growth and denitrification were 6.0 and 35 ℃， respectively. And the NO3--N removal rate of the strain MCW148 was 62.4% in the optimal conditions for 12 h.

Key words： aerobic denitrification bacteria； Bacillus megaterium； denitrification； salt tolerance

中國是世界上海水养殖发达的国家，养殖面积和总产量均居世界首位。海水养殖正成为中国近岸海域的重要污染源。以养虾为例，即使是管理最好的养虾场，也有30%的饵料未被摄食，残饵溶生的氮、磷营养物质是虾池及其邻近浅海的主要污染源。在高密度的水产养殖体系中，饲料中75%～80%的氮会进入养殖水体中，并以氨氮、亚硝酸盐氮的形式出现不同程度的累积，对水产养殖动物造成危害，从而限制了海水养殖的单位产量，并且其排放的废水中也含有丰富的含氮化合物，会加快海水富营养化，造成赤潮灾害，给近岸海洋生态环境带来了危害[1]。因此，研究快速消除养殖环境中有机污染的方法，以尽快恢复和优化养殖环境，对中国海水养殖业的健康发展以及滩涂和浅海资源的可持续利用具有重要的理论和现实意义。自从第一株好氧反硝化菌在1984年首次发现[2]以来，国内外陆续有大量菌株被分离出来[3-8]。好氧反硝化菌是一类能在好氧或兼氧条件下进行反硝化的细菌，它的存在使得硝化过程和反硝化过程得以在一个反应器中同步进行，硝化反应的产物可成为反硝化反应的底物，加快了反应速度，降低了运行成本，同时反硝化反应释放的OH-会补偿硝化反应消耗的碱，避免酸性物质的积累，维持系统pH的稳定[8，9]。本试验主要对1株耐盐好氧反硝化细菌MCW148进行了鉴定，研究了该菌株高效代谢硝酸盐氮的生理生化特性，及其最佳培养条件和生长特性，为好氧反硝化菌在海水养殖废水处理中的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种富集、分离纯化和培养基组成[4]

称取1 g样品放入装有9 mL无菌水的试管中，80 ℃水浴20 min，充分振荡混匀，取1 mL 到下一个同样的试管中，依次稀释得到各种浓度的菌悬液。分别取10-5～10-7 3个稀释梯度的稀释液0.1 mL涂布于NA平板上，然后倒置于培养箱中37 ℃培养24 h。挑取不同形态的单菌落转接至NA斜面上，37 ℃恒温培养24 h，置于4 ℃冰箱保存备用。所挑取菌落同时在NA培养基平板上划线检验纯度。

菌株分离培养基（NA）：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂20.0 g，pH 7.2～7.4，蒸馏水1 000 mL。

硝酸盐还原产气培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，KNO3 1.0 g，pH 7.2～7.4，蒸馏水1 000 mL。

种子培养基：葡萄糖10.0 g，CaCl2 0.2 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，（NH4）2SO4 2.0 g，KCl 0.2 g，乙酸钠 3.32 g，pH 7.2～7.4，蒸馏水1 000 mL。

反硝化基础培养基：KNO3 2.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，KH2PO4 0.5 g，葡萄糖 10.0 g，pH 7.2～7.4，蒸馏水1 000 mL。

1.2 反硝化性能测定

250 mL三角瓶中加入100 mL反硝化性能测定培养液，灭菌后加入1 mL培养至对数期的菌液，置于120 r/min、30 ℃下培养，每3 h取样测定培养基中的NO3--N、NO2--N浓度和细菌生长量（以吸光度OD600 nm表示）。

1.3 菌株的鉴定

菌落形态及生理生化鉴定：30 ℃培养24 h，观察菌落形态；革兰氏染色、碳源利用等生理生化指标测定参照文献[10]的方法进行。

16S rDNA PCR扩增和序列测定：将菌株保存至平板中，送往上海生工生物工程技术服务有限公司完成测序和分析。

1.4 菌株生长条件及脱氮特性

1.4.1 最适碳源 分别以葡萄糖、乙酸钠、丁二酸钠、草酸钠、柠檬酸钠为碳源，贫营养反硝化性能测定培养基中的其他成分不变，灭菌后按照1%的量加培养至对数期的菌液，然后置于120 r/min、30 ℃条件下培养，分别在0、12、24、36、48 h取样测定培养基中的NO3--N、NO2--N浓度，计算其去除率。

1.4.2 最适温度 以葡萄糖为碳源，配制化学需氧量（COD）为200 mg/L、NO3--N质量浓度为10 mg/L的贫营养反硝化性能测定培养基，灭菌后按照1%的量加培养至对数期的菌液，分别置于15、20、25、30、35、40 ℃下，120 r/min连续振荡培养24 h，测定培养液中的NO3--N浓度，计算其去除率。

1.4.3 最适初始pH 培养温度30 ℃，初始pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，其他试验设计同“1.4.2”。

2 结果与分析

2.1 样品的富集培养及菌种的分离纯化

污泥样经过3次富集培养后得到混合微生物的培养物，它可以在含有200 mg/L NO3--N的合成培养基（FM）中生长，在培养过程中通过测定培养液的OD600 nm和NO3--N的浓度，发现该混合培养液中的NO3--N含量不断减少，而OD600 nm不断上升，说明该混合液培养物具有很强的好氧反硝化能力。

上述混合培養物在对氯苯胺的BTB平板上进行划线分离，挑取单菌落，经过复筛、纯化后得到1株具有高效脱氮功能的耐盐好氧反硝化细菌菌株MCW148。

2.2 MCW148菌株反硝化性能

通过实验室模拟养殖系统废水的水质（表1）分析，把MCW148菌株接种于NO3--N初始浓度为150 mg/L的合成培养基中，30 ℃、120 r/min摇床培养，定时取样测定菌体生长、NO3--N和NO2--N的浓度情况。结果（图1）表明，MCW148能在12 h内将NO3--N浓度从140 mg/L以上降至0.05 mg/L以下，同时，NO2--N的浓度先逐步升高，然后逐步降低至0.05 mg/L以下，说明MCW148菌株具有高效的反硝化脱氮能力。另外，由图1还可知，MCW148菌株的生长同步于NO3--N浓度的降低，且MCW148菌株的生长曲线、NO3--N的代谢曲线中的迟缓期基本都在0～3 h，然后进入对数期（4～15 h），约在24 h达到最高的菌体生长量。

2.3 菌株的鉴定

菌株MCW148在LB培养基平板上培养2 d的菌落为乳白色，圆形，中间凸出，表面光滑湿润，直径在1 mm左右；细胞呈直杆状，1.0 μm×3.0 μm，革兰氏阳性，常以成对或链状排列，单极毛（图2）。接触氧化酶阳性；可利用葡萄糖、柠檬酸钠、阿拉伯糖、木糖等为碳源，但利用葡萄糖效果最好；硝酸盐还原和反硝化阳性。扩增菌株MCW148的16S rRNA部分基因，长度为1 516 bp。序列分析表明该菌株与巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）的同源性最高，为99%[4，11]。结合菌株的形态和生理生化特征，将菌株MCW148初步鉴定为巨大芽孢杆菌。目前，国内外在好氧反硝化菌领域进行了大量的研究[12-16]，但在芽孢杆菌属中，具有耐盐和好氧反硝化能力的细菌却鲜有报道。

2.4 MCW148菌株生长条件及脱氮特性

2.4.1 最适碳源 分别以葡萄糖、乙酸钠、丁二酸钠、草酸钠、柠檬酸钠为碳源，贫营养反硝化性能测定培养基中的其他成分不变，接种MCW148菌株，在30 ℃、120 r/min摇床条件下培养2 d，定时取样测定NO3--N浓度。图3的结果表明，菌株MCW148能够利用多种碳源进行脱硝酸盐氮，其中，碳源为葡萄糖时，NO3--N的去除效果最佳，培养12 h去除率便达到了62.4%；其次是柠檬酸钠，NO3--N在培养12 h时去除率为34.2%，24 h去除率达到了59.7%；丁二酸钠、草酸钠24 h的NO3--N去除率分别为45.8%和33.7%；而菌株MCW148基本不利用乙酸钠为碳源。因此，葡萄糖为菌株MCW148的最适碳源。

2.4.2 最适温度 由图4可知，MCW148菌体生长和反硝化的温度适宜范围为30～40 ℃，在35 ℃时NO3--N去除率最高，为74%。另外，由图4可以看出，MCW148的生长和反硝化存在一个临界温度，即25 ℃，一旦低于这个温度，MCW148的生长和代谢活性显著降低，因此，该菌嗜高温而对低温非常敏感，建议35 ℃为其最适生长温度。

2.4.3 最适初始pH 由图5可知，MCW148菌株在pH 5～9的范围内对NO3--N的代谢去除活性均较高，其最佳pH为6，此时的NO3--N去除率为60%。

3 小结

本研究从渤海某海水养殖场（北美白对虾）底泥中分离到1株耐盐高效好氧反硝化细菌，经过对其形态特征、生理生化以及16S rDNA序列分析，初步鉴定为巨大芽孢杆菌。该菌株在去除NO3--N的同时，也能降解COD。菌株MCW148在不同种类碳源下去除NO3--N的能力由大到小依次为葡萄糖、柠檬酸钠、丁二酸钠、草酸钠、乙酸钠。其生长和代谢NO3--N的最佳条件是温度35 ℃、pH 6，在此条件下，盐度为3%时，菌株MCW148能达到最佳生长状况和最大去除率，12 h对NO3--N的去除率为62.4%。

菌株MCW148具有生长速度较快、对NO3--N去除率高的特点，今后，将对该菌株的代谢机理、酶的影响等方面做进一步的探讨和研究，并结合其他脱氮微生物以及固定化技术，可为海水水产养殖水质改良等方面提供技术支持。

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