广金钱草中槲皮素的定性分析及其与β－乳球蛋白相互作用的电喷雾质谱研究

徐康宁，黄 娟，王 献

（中南民族大学化学与材料科学学院，湖北 武汉430074）

广金钱草是豆科植物广金钱草的干燥地上部分，性微寒，具有清热去湿、排石、利水通淋的功效[1］，临床主要用于治疗肾炎浮肿、尿路感染、胆囊结石、黄疸性肝炎等疾病[2－3］，其主要成分为黄酮类物质。槲皮素是广金钱草中主要的黄酮类物质，化学名称是3，3′，4′，5，7－五羟基黄酮，具有消炎、抗病毒、抗氧化、降糖降压、保护心血管等药理功能和生物活性[4－5］，能抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡[6－7］。然而槲皮素水溶性差，生物利用率低，导致其在医学和保健领域的应用受到极大限制[8］。槲皮素与牛血清白蛋白相互作用会影响槲皮素的抗氧化性[9］。Rawel等[10］发现大豆球蛋白与槲皮素的相互作用对其热稳定性有益。β－乳球蛋白存在于大多数哺乳动物的乳汁中[11－12］，是乳清蛋白的主要成分，有较强的配体结合能力，可以作为优良的生物相容性载体材料[13－14］。研究β－乳球蛋白与槲皮素的相互作用对深入研究药物活性物质的有效活性和配伍关系、开发其在健康保健领域的应用具有重要意义。

电喷雾电离（ESI）是一种软电离技术，能够保持生物大分子的结构和生物功能，被广泛应用于非共价键作用的研究，尤其是蛋白质与配体小分子的相互作用，具有快速高效、高灵敏度、高精确度、易于推导出化合物的化学计量比等优点[15－17］。作者采用电喷雾质谱法研究了β－乳球蛋白与槲皮素的相互作用，探索了两者结合的反应条件，分析了两者发生结合的可能性与结合程度，拟为深入了解药物中槲皮素和β－乳球蛋白的药效作用提供实验依据和新的思路。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

广金钱草（产地：广东），粉碎过筛，备用。

槲皮素（纯度≥98%）、超纯水（18.25MΩ）、乙酸铵（分析纯），阿拉丁试剂有限公司；β－乳球蛋白（18 277Da，纯 度 ≥90%），Sigma公司；乙 醇 （分 析纯），国药集团化学试剂有限公司。

Agilent LC－Q－TOF－MS 6520型液相色谱－质谱联用分析仪，美国安捷伦公司；KQ－250DB型数控超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；FA1004型电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SHZ－03型高精度数控摇床，上海堪鑫仪器设备有限公司。

1.2 广金钱草提取液的制备与表征

准确称取10g广金钱草粉末装入带塞三口烧瓶中，加入100mL70%乙醇溶液，室温浸泡3h后超声提取1h，90℃加热回流2h，冷却，取3mL提取液置于离心管中，1 000r·min－1离心20min，取上层清液10μL稀释100倍，稀释液经0.45μm微孔滤膜过滤后，取滤液进样。

色谱条件：C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）；柱温40℃；流速0.2mL·min－1；梯度洗脱条件见表1 ；进样量2μL。质谱条件：电喷雾离子源；负离子检测模式，离子扫描范围（m／z）200～1 000；干燥气温度300℃；干燥气流速10L·min－1；雾化器压力206.8 kPa；毛细管电压3 500V；碎裂电压125V。

表1 梯度洗脱条件Tab.1 Gradient elution condition

1.3 槲皮素与β－乳球蛋白混合溶液的配制

配制pH＝7.4的乙酸铵缓冲液，备用。将β－乳球蛋白用乙酸铵缓冲液（pH＝7.4）配制成浓度为100 μmol·L－1的溶液，置于4℃下备用。β－乳球蛋白和槲皮素混合溶液按照1∶0、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的不同浓度比进行配制，最终蛋白质在各溶液里的浓度为5μmol·L－1。

1.4 β－乳球蛋白与槲皮素的相互作用研究

仪器条件：β－乳球蛋白与槲皮素的相互作用在ESI－Q－TOF－MS正离子模式下进行检测，待测样品由自动进样器以标准方式进样。液相色谱的流动相为100%的超纯水，进样量为30μL，流速为0.05mL·min－1。电喷雾质谱条件：干燥气温度200℃；干燥气流速10L·min－1；喷雾器压力172.4kPa；毛细管电压3 500V；碎裂电压175V；质谱采集范围（m／z）1 000～3 200。

样品的孵育与检测：将按1.3方法配制好的不同浓度比的β－乳球蛋白与槲皮素的混合溶液置于25℃恒温箱中孵育45min，然后在上述仪器条件下进行检测，得到各浓度比的β－乳球蛋白与槲皮素相互作用的质谱图与去卷积质谱图。

2 结果与讨论

2.1 黄酮类物质的定性分析

对广金钱草提取液进行负离子模式分析，以其中的槲皮素为例，其提取离子色谱图和质谱图见图1、图2。

图1 槲皮素的提取离子色谱图Fig.1 Extracted ion chromatogram of quercetin

图2 槲皮素的质谱图Fig.2 Mass spectrum of quercetin

结合图1、图2定性结果，槲皮素的m／z 301.03827对应为[M－H］－，与理论质量数仅相差0.00289，分子式：C16H12O7。

根据高分辨质谱检测特征离子峰的精确质量数，共检测出10种天然黄酮类化合物（表2 ），它们分别为夏佛塔苷、芹菜素、柚皮素、异鼠李素、山奈素、异荭草苷、牡荆素、槲皮素、山奈酚、金丝桃苷和一种有机酸绿原酸（未列入表中）。

2.2 β－乳球蛋白与槲皮素的相互作用

非共价键复合物的质荷比位移可通过式（1）计算：

式中：Mwprotein和Mwligand分别是小分子和蛋白质的分子量；i是气相中由正离子模式检测到的蛋白质的电荷价态；j是单个蛋白质结合的小分子数目。

自然态的β－乳球蛋白有＋7至＋11多电荷峰，信号较强的为＋9与＋8电荷峰，以＋9电荷对应的峰对β－乳球蛋白及其复合物进行研究。β－乳球蛋白的质量数是18 277Da，＋9多电荷峰中蛋白质的质量数是2 031.7Da，槲皮素的质量数是302Da，因此，在β－乳球蛋白的＋9多电荷峰中小分子的质量数位移为33.5 Da，如图3所示。

表2 广金钱草中黄酮类物质的定性分析Tab.2 Qualitative analysis of flavonoids of Desmodium styracifolium（Osb.）Merr.

图3 β－乳球蛋白与槲皮素在不同浓度比时相互作用的质谱图Fig.3 The mass spectra of the interaction between β－lactoglobulin and quercetin at different concentration ratios

由图3可知，β－乳球蛋白能够与槲皮素结合，且结合数目随着浓度比的增大而不断增加，在1∶10的浓度比时，结合配体分子的数目最多，单个β－乳球蛋白最多能够结合6个槲皮素小分子。

为了进一步研究β－乳球蛋白与槲皮素结合能力的强弱，将上述质谱图通过去卷积得到了去卷积质谱图，见图4。

β－乳球蛋白的质量数是18 277Da，槲皮素质量数是302Da，从图4可以看出，当复合物的质量数是18 579Da、18 881Da、19 183Da、19 485Da、19 787 Da、20 089Da时，分别结合了1、2、3、4、5、6个槲皮素小分子。

图4 β－乳球蛋白与槲皮素在不同浓度比时相互作用的去卷积质谱图Fig.4 The deconvoluted mass spectra of quercetin binding to β－lactoglobulin at different concentration ratios

乳制品中的乳糖作为还原糖，通常可与少量β－乳球蛋白发生美拉德反应，对蛋白质的活性有抑制作用，反应中间产物为乳果糖基赖氨酸，质量数比β－乳球蛋白增加324Da[18］，对应的离子峰为2 067.7Da。由图3可见，在高浓度比时，槲皮素与β－乳球蛋白的结合能力比乳糖强，美拉德产物对应的离子峰强度逐渐降低，槲皮素一定程度上抑制了β－乳球蛋白与乳糖的美拉德反应。

2.3 β－乳球蛋白与槲皮素相互作用的结合常数

采用式（2）～（5）计算β－乳球蛋白与槲皮素相互作用的结合常数[19－21］。

Rj代表复合物浓度与未结合配体的蛋白质的浓度之比。

[L］是溶液平衡态时的自由小分子浓度，可由式（4）计算：

[P0］是蛋白质总浓度，[L0］是配体小分子总浓度。所以式（3）又可写成：

由于复合物浓度以及蛋白质浓度与质谱图中离子的信号强度成正比，故其浓度比Rj可以由去卷积质谱图中相应峰的丰度比来表示，代入式（5）即可计算得到不同浓度比时的结合常数，结果见表3 。

表3 β－乳球蛋白与槲皮素在不同浓度比时的结合常数Tab.3 Binding constants of quercetin binding to β－lactoglobulin at different concentration ratios

由表3 可知，随着浓度比的增大，单个β－乳球蛋白能结合的槲皮素数目持续增加，当浓度比为1∶10时，单个β－乳球蛋白分子可以结合6个槲皮素分子，结合常数数量级为104，结合效果良好。

3 结论

利用高效液相色谱－质谱技术检测出了广金钱草中10种黄酮类化合物，通过ESI－Q－TOF－MS方法快速直观地研究了槲皮素和β－乳球蛋白的相互作用，计算得到了不同浓度比时β－乳球蛋白与槲皮素的结合数目和结合常数。高浓度的槲皮素可以抑制β－乳球蛋白与乳糖的美拉德反应，提高蛋白质的营养价值。由于β－乳球蛋白的生物相容性好，与其结合有可能提高槲皮素的生物利用率、增强保健功效。研究β－乳球蛋白与槲皮素的作用，为探索蛋白质大分子与黄酮类小分子的相互作用提供了实验依据，黄酮与蛋白质的非共价作用可为改善药物的配伍和给药方式提供参考。

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