大鼠骨髓间充质干细胞体外培养体系的建立

李 丹 张金国

（济宁医学院2013级研究生，山东 济宁272067；济宁医学院附属医院，济宁272029）

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是目前组织工程建设的种子细胞，但因其在骨髓中含量极低，体外细胞纯化、扩增培养难度较大，严重影响BMSCs后续实验研究。目前提取方法主要有4种：全骨髓贴壁培养法、密度梯度离心法、免疫磁珠法和流式细胞仪分离法［1］。由于全骨髓贴壁培养法获得的细胞活性强，增殖旺盛，并且具有操作简单，造价低等优点，本文采用贴壁法进行体外培养。报道如下。

1 材料和方法

1．1 实验动物

体重100g左右健康清洁SD大鼠，雌雄不限，由济宁鲁抗生物有限公司提供。

1．2 试剂及仪器

1．2．1 试剂 DMEM／F12 1∶1（Gibco公司）；胎牛血清（Gibco公司）；0．25%胰蛋白酶（Gibco公司）；青链霉素混合液（genview公司）；CD90、CD45抗大鼠荧光表面抗体（eBioscience公司）。

1．2．2 仪器 超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；倒置显微镜（OLYMPOS公司）；细胞培养箱 （Thermo公司）。

1．3 大鼠BMSCs体外培养体系的建立及鉴定

1．3．1 大鼠BMSCs的提取 称取100g左右健康清洁SD大鼠一只，脱臼处死后完全浸泡于75%

酒精中5min。将大鼠置于灭菌后的手术台上，依次剪开皮肤、皮下组织，剥离肌肉，完整取下双侧股骨及胫骨，放置装有PBS的无菌培养皿中，清除肌肉组织，并用PBS反复冲洗3遍。在超净台内剪开双侧骨端，用1ml针头吸取含10%胎牛血清的DMEM／F12培养基反复冲洗骨髓腔，直至骨体发白，将骨髓液收集至15ml离心管中，1000rpm，5min离心，收集细胞。

1．3．2 大鼠BMSCs的体外培养 用5ml含10%完全培养基重悬细胞，反复吹打，制备单一细胞悬液。在细胞计数板上计数，以1×109／L密度接种于25cm2的细胞瓶中，置于37℃，CO2浓度为5%的饱和适度培养箱内培养。72h后全量换液，并用PBS反复冲洗，将悬浮细胞去除。每间隔2d换液，第7天细胞融合至80%左右，胰酶消化，并严格控制消化时间，待镜下观察梭形细胞变形后，立即用完全培养基5ml终止消化，收集细胞悬液，1000rpm，5min离心。将收集的细胞以1∶2接种于25cm2的细胞瓶中，继续培养，传代后细胞生长迅速，依次传代记为P1，P2，P3等。

1．3．3 大鼠BMSCs的表型鉴定 取P3代生长良好的细胞，胰酶消化后，PBS反复冲洗两遍，收集离心后的细胞，根据流式细胞荧光抗体的要求，按每管1×106／L密度置于4个流式专用上机管中，分别加入CD90抗体和同型、CD45抗体和同型各5μl，充分混匀细胞悬液后，避光静置15min后，各管加入1ml PBS，1200rpm，离心5min，洗涤细胞。用400μl PBS重悬细胞后上机，根据收集的荧光信号，判断细胞阳性率。

1．3．4 操作注意事项 1）提取、培养细胞过程中严格无菌操作，添加必要抗生素，减少污染概率。2）提取过程中注意保持股骨端的完整性，避免其它杂细胞的污染。3）反复吹打获得的细胞悬液，制备单一的细胞悬液，有利于BMSCs的贴壁生长。4）避免反复观察细胞，严格控制首次换液时间，减少培养液晃动对细胞的不利影响。

2 结果

2．1 大鼠BMSCs的形态特征

提取细胞接种于培养瓶后，呈大小不一的圆形，悬浮于培养液中。24h后瓶内出现少量贴壁细胞，呈梭形、椭圆形、多角形等，小片状聚集生长，细胞生长缓慢。72h后首次全量换液，去除不贴壁的造血细胞等悬浮细胞，可见贴壁细胞增多，呈现梭形、纺锤形，呈片状聚集生长。2天后换液，细胞增长速度明显增快，生长逐渐融合，继续培养至7d，细胞融合达80%左右，梭形细胞为主，胰酶消化传代至P3代时，细胞生长速度较前明显增快，梭形细胞克隆状生长，形态趋于稳定。见图1。

图1 不同培养时间BMSCs贴壁情况

2．2 大鼠BMSCs的鉴定结果

取生长旺盛的P3代细胞，应用流式细胞仪进行细胞表型鉴定：CD90阳性表达率99．2%，CD45阳性表达率0．9%，符合BMSCs鉴定标准，说明原代培养的BMSCs具有纯度高，均一性强的特性。见图2。

3 讨论

BMSCs因其自身具有多向分化潜能，取材容易，体外培养后可以高度纯化、大量扩增等优点，成为组织工程的种子细胞，已被应用于许多领域的研究，并成功诱导分化为骨、软骨、脂肪、神经、心肌等细胞［2－5］，使得多年以来干细胞的诱导分化，干细胞的移植治疗始终是研究的热点［6－7］，目前这些研究已初步取得一定疗效［8］，为临床疾病的治疗提供了新思路，为临床患者带来曙光。

本实验成功分离、提取大鼠BMSCs。采用全骨髓贴壁培养法建立体外培养体系，经表面抗原表型鉴定为纯化BMSCs，并通过严格控制消化时间，严格无菌操作，成功实现BMSCs的体外大量扩增，为进一步的实验研究提供细胞来源，促进了干细胞诱导分化、移植治疗的进一步研究。并通过总结实验中的注意事项，大大提高了BMSCs提取及培养的成功率，避免了培养过程中时间的浪费，节省了科研经费，提高了科研的准确性。

图2 CD90、CD45表达情况

BMSCs在骨髓中含量仅0．001%～0．1%，各种分离方法各有优缺点，至今尚无最佳分离培养方案。免疫磁珠法、流式细胞仪法因其对细胞活性损伤较大，甚至导致细胞死亡，并且造价昂贵，对实验室要求较高等原因，未能广泛应用。密度梯度离心是根据骨髓中各种细胞比重不同，通过加入percon液或淋巴细胞分离液提取相对较纯的BMSCs，但因多次离心，破坏了BMSCs生存的骨髓微环境，不利于细胞生长。而全骨髓贴壁培养法利用BMSCs的贴壁生长特性，通过不断换液，去除悬浮细胞，是目前操作最简单有效的方法。

由于BMSCs细胞表面尚未有特异抗体表达，目前多采用阳性表面标记物及阴性表面标记物相结合的办法鉴定。国际细胞治疗学会间充质及组织干细胞委员会在2006年提出了鉴定人来源的间充质干细胞最低的3条标准［9］：1）必须具备对塑料底物的贴壁特性。2）CD105、CD90、CD73等阳性表达率≥95%，而CD45，CD34，CD14或CD11b，CD79a或CD19，HLA－DR等的阳性表达率≤2%。3）体外诱导分化具有多向分化潜能。本文对P3代生长旺盛的细胞给予标记CD90、CD45进行表面抗原鉴定，结果显示CD90表面抗原阳性，CD45表面抗原阴性，虽然大鼠与人物种存在差异，但目前鉴定标准仍采用2006年标准进行［10］。

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