甲型流感病毒M1、M2和M42蛋白研究进展

谭 伟，谢芝勋

（广西壮族自治区兽医研究所，广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁530001）

流感病毒属于正黏病毒科，是单股负链、分节段的RNA 病毒。流感病毒基因组约为13kb，含有8个基因节段，分别编码血凝素（haemagglutinin，HA）、神经氨酸酶（neuraminidase，NA）、M1 基质蛋白（matrix protein 1，M1）、M2 离子通道蛋白（M2ion－channel protein，M2）、NP核蛋白（nucleoprotein，NP）、NS 非结构蛋白（nonstructural proteins，NS1、NS2）及RNA 聚合酶复合体（PB1蛋白、PB2蛋白、PA 蛋白）［1－3］。按照甲型流感病毒基因的大小，可将它们分为8个基因节段，即节段1（PB2基因）、节段2（PB1 基因）、节段3（PA 基因）、节段4（HA 基因）、节段5（NP 基因）、节段6（NA 基因）、节段7（M 基因）和节段8（NS基因）［1］。

目前的研究发现流感病毒至少可编码15种病毒蛋白［4］，其中PB2基因、HA 基因、NP基因和NA基因只能分别编码1种蛋白，它们分别是PB2、HA、NP及NA 蛋白。而PB1基因、PA 基因、M 基因和NS基因则能分别编码2种或2种以上的病毒蛋白，如PB1基因可以编码PB1、PB1－F2及PB1－N40 3种蛋白；PA 基因能编码PA、PA－X、PA－N155 和PAN182 4种蛋白；M 基因可以编码M1、M2和M42 3种蛋白；而NS 基因则能编码NS1 和NS2 2 种蛋白［4］。

M 基因在未经剪接的情况下产生mRNA1 转录体，只编码M1 基质蛋白。2012 年Wise H M等［4－5］发 现 流 感 病 毒M 基 因 经mRNA 选 择 性 剪 接后可产生3 种不同结构的mRNAs，即mRNA2、mRNA3和mRNA4。mRNA2可编码由97个氨基酸（amino acid，aa）组成的M2离子通道蛋白；mRNA3可能会编码由9 个aa 组成的一个短肽；而mRNA4则编码一个新的流感病毒蛋白，即M42蛋白，由99个aa所组成［5］。本文将对流感病毒M 基因所编码的M1、M2及M42蛋白进行深入介绍。

1 M1基质蛋白

流感病毒M 基因含1 027 个核苷酸（nucleotides，nt），编码由252个aa组成的、分子质量约为28ku的M1蛋白［1］。M1蛋白在流感病毒颗粒中的含量最高，每个病毒颗粒大约含有3 000 个M1 蛋白［1］。M1蛋白位于病毒囊膜下，起到连接病毒囊膜和核衣壳的作用，并可影响病毒的形态及构型。M1蛋白在病毒感染细胞的后期才被合成，能与病毒核糖核蛋白体（viral ribonucleoproteins，vRNPs）相互作用，抑制病毒mRNA 的转录，并协助vRNPs从细胞核转运到细胞浆［6］。M1蛋白与流感病毒复制有关，能与HA 及NA 蛋白相互作用，并参与病毒子粒的装配及释放［6－7］。

1.1 M1蛋白含有细胞核定位信号及核外运信号

在流感病毒感染的细胞内，大部分M1蛋白与镶嵌于细胞膜中的HA 及NA 蛋白的C 末端相结合，而另一部分M1蛋白则可以进入细胞核，这是因为M1 蛋白含有核定位信号（nuclear localization signal，NLS）［6－7］。M1 蛋 白 可 分 为3 个 区，即N 末端区、中间区和C 末端区。N 末端区（aa1－aa86）含有 核 外 运 信 号（nuclear export signal，NES）（59ILGFVFTLTV68）［8］；中间区（aa87－aa164）有一富含碱性氨基酸的区域，内有1 个 NLS（95KAVKLYRKLKR105）及与NS2蛋白结合的位点；C 末 端 区（aa165－aa252）能 与vRNPs 相 互 作用［6］。在成熟的病毒颗粒内，M1蛋白以2种形式存在，与锌结合和不与锌结合的形式，提示锌可能参与调节M1蛋白的功能［9］；另外，M1蛋白的磷酸化状态也会影响M1蛋白的功能，从而影响流感病毒复制［10－11］。

1.2 M1蛋白和NS2蛋白共同参与vRNPs的核外运过程

与大多数RNA 病毒不同，流感病毒是在被感染细胞的核内进行复制的［12］。在流感病毒感染细胞的早期阶段，vRNPs需要从细胞浆进入细胞核；而在病毒感染的晚期阶段，vRNPs则需要从细胞核被运送到细胞浆，参与新的病毒颗粒的装配。vRNPs的主要成分包括病毒RNA、NP 蛋白及RNA 聚合 酶 复 合 体（PB1、PB2、PA）［6－7］。据 报 道，M1蛋白、NS2 和NP 蛋白均参与将流感病毒的vRNPs从细胞核转运到细胞浆的过程［8，13－15］。

M1蛋白的NES富含亮氨酸，在甲型流感病毒中很保守，但在乙型或丙型流感病毒的M1蛋白中没有发现类似的NES［8］，提示乙型和丙型流感病毒的M1蛋白可能含有不同的NES，或与其他的蛋白相互作用被运出细胞核。NS2蛋白又被称作核外运蛋白（nuclear export protein，NEP），其N 末端含有NES（11DILLRMSKMQLES23）［7］。在 细 胞 核 内，当M1蛋白的C末端与vRNPs结合后，M1蛋白的N 末端能与NS2蛋白的C 末端相结合。NS2蛋白N 末端的NES 可以和染色体区维持蛋白1（chromosome region maintenance protein 1，CRM1）结合，而CRM1通过与RanGTP 蛋白结合，就可以将vRNPs－M1－NS2－CRM1－RanGTP 复 合 体 运 送 至 细胞浆［7，16］。目前还不清楚有多少M1－NS2聚合体能与vRNPs结合。另外，M1－NS2只能与含流感病毒负链RNA 的vRNPs结合，而不能与含病毒正链RNA 的vRNPs结合，但M1－NS2聚合体是如何区分病毒的负链和正链RNA 的机制目前还不清楚。

2 M2离子通道蛋白

2.1 mRNA2转录体编码M2蛋白

M2蛋白是Lamb等于1981年首次发现的，由mRNA2转录体所编码，而此转录体是由编码M1蛋白的mRNA1 经过选择性剪接而产生的。mRNA1含有3个剪接供位（splice donor site，SD），分别是SD1、SD2和SD3［5］。若将含有mRNA1 的表达载体转染细胞，则能检测到mRNA3的表达，但很难测到mRNA2转录体的表达；只有当流感病毒感染细胞的时候，才能检测到mRNA2的表达，这是由于流感病毒的聚合酶复合体可以封闭SD1，同时激活SD2，并启动mRNA2的表达［17］。

2.2 M2蛋白的结构特点及其功能区

mRNA1与mRNA2 的5′末端所含的51 个核苷酸是相同的，但它们的3′末端序列则不同。M2是由97个氨基酸残基组成的膜蛋白，分子质量约为15ku，而28ku 的M1 蛋白则位于病毒囊膜之下［1，4］。M2与M1蛋白N 末端的9个氨基酸相同（MSLLTEVET），但C 末端的氨基酸序列却不同［18］。M2蛋 白 可 分 为3 个 功 能 区［18］：①N 末 端区，含24个氨基酸，暴露于病毒囊膜表面；②跨膜区，由19个氨基酸组成；③胞浆区，由54个氨基酸组成。M2蛋白除了与病毒脱壳有关，还参与病毒子粒的装配并影响病毒的形态结构［5］。

2.3 M2蛋白具有质子通道的功能

M2蛋白是除HA 及NA 蛋白之外的又一个病毒表面蛋白，但它并不是流感病毒复制所必需的［5］。虽然M2在病毒颗粒表面的数量有限，但很容易在流感病毒感染的细胞表面检测到M2蛋白［19］。M2蛋白可形成由同源四聚体组成的阳离子通道，此通道受pH 调节，能够在酸性条件下被激活［20－22］，导致病毒颗粒内部的pH 下降，促使M1蛋白构像发生改变并与vRNPs分离，病毒脱壳后vRNPs被释放到细胞浆中［7，23］。

2.4 M2蛋白外膜的氨基酸序列在甲型流感病毒中高度保守

M2蛋白与HA 蛋白的成熟有关，并能与M1蛋白相互作用参与新的病毒颗粒的装配［4］。金刚烷胺（amantadine）是M2 蛋白的抑制剂，Davies等最先报道了金刚烷胺具有抗流感病毒的作用，随后Hay A J等［24］证明金刚烷胺的作用靶位是M2蛋白。由于流感病毒容易突变，常产生对金刚烷胺的耐药性，所以一般不首选金刚烷胺类药物治疗流感病人［25］。M2蛋白的N 末端含有24个氨基酸，暴露在病毒囊膜表面或存在于被流感病毒感染的细胞表面，这24个氨基酸被称作M2e。M2e的氨基酸序列相对不易突变，在甲型流感病毒株中高度保守，尤其是其N末端的8个氨基酸（aa2～aa9：SLLTEVET）在几乎所有亚型的甲型流感病毒中都是不变的，因此它也是研制流感通用疫苗的主要候选免疫原之一［26］。

3 M42蛋白

3.1 mRNA4转录体编码M42蛋白

流感病毒M 基因经细胞的mRNA 选择性剪接后可以产生mRNA4转录体，它可以编码一个与M2相关的蛋白，即M42 蛋白［5］。通过M 基因产生的转录体mRNA2、mRNA3及mRNA4含有相同的3′端剪接受位（splice acceptor site，SA），但它们5′端的剪接供位却不尽相同［4－5］。M1与M2蛋白所使用的是同一个翻译起始密码子 AUG1（nt26 ～nt28）［5］，但此起始密码子AUG1 附近的核苷酸与Kozak序列略有不同，即AUG1并非处于蛋白翻译所需的最佳序列环境。距离AUG1起始密码子－3位上的核苷酸虽是A，但＋4 位上的核苷酸却不是G。根据蛋白质合成的漏过扫描翻译模式，位于AUG1下游的AUG 也有可能作为翻译起始密码子启动蛋白的合成，而M42蛋白正是使用了位于114位的AUG2（nt114～nt116）作为其蛋白翻译的起始密码子［5］。

3.2 M42蛋白与M2蛋白的结构相似

M2蛋白可以编码97个氨基酸，而M42蛋白可以编码99个氨基酸。由于M2和M42蛋白合成使用了不同的起始密码子和不一样的翻译阅读框架，所以这两种蛋白的氨基酸序列有所不同。M2蛋白的外膜部分含有24个氨基酸，而M42蛋白的外膜部分则含有26个氨基酸。这两个蛋白的外膜部分有15个氨基酸是相同的，而外膜的其余部分则不一样，因此M42与M2蛋白的外膜部分的抗原性有所不同［5］。但从M2蛋白N 末端的第10个氨基酸（也就是从M42蛋白N 末端的第12 个氨基酸）开始，M42蛋白与M2蛋白的序列是相同的，这可能就是为什么M42蛋白能够替代M2蛋白，并具有M2蛋白的功能的主要原因［5］。

3.3 M42 蛋白参与流感病毒的复制并具有类似M2蛋白的功能

Wise H M 等［5］发 现，mRNA2 的 表 达 水 平 与mRNA4的表达量呈负相关，当mRNA2 表达量变低时，mRNA4的表达量会增高，而且mRNA4编码的M42蛋白可在体内和体外试验中替代M2 蛋白的功能。mRNA4最初是在甲型流感病毒A／WSN／33（WSN）株中被发现，但却未能在A／Udorn／72（Udorn）／（H3N2）株中检测到［27］，说明mRNA4的表达可能受到某些细胞因子的调控。M42蛋白不是流感病毒复制所必需的，因为M42蛋白仅在一些流感病毒株中表达［5］。由于mRNA4 是通过mRNA选择性剪接所产生的，而哺乳动物细胞内的mRNA选择性剪接具有种属和细胞特异性，因此mRNA4的表达可能仅限于被流感病毒感染的某些特定种属的动物或细胞类型。

M42蛋白与M2 蛋白具有相同的跨膜区，可M42蛋白是否具有依赖于pH 的阳离子通道作用目前还不太清楚。Wise H M 等［5］的研究发现，在实验室构建的流感病毒株PR8 MUd能表达M42 蛋白，而不表达M2蛋白，但此毒株对药物金刚烷胺敏感，提示M42蛋白可能也具有介导阳离子转运的功能。M42被认为是流感病毒的辅助蛋白，但它可以提高流感病毒在体外细胞培养中的繁殖效率。M42蛋白在病毒囊膜外的抗原性与M2蛋白不同，但它在体内和体外试验中均可表现出与M2蛋白类似的功能。M42蛋白和M2蛋白在感染细胞内的分布是不同的，M2蛋白镶嵌在被感染细胞膜中，而M42蛋白则主要是位于高尔基氏体内［5］。

4 小结与展望

目前研究人员已发现，流感病毒的PB2、HA、NP和NA 4个基因分别只能编码一种病毒蛋白，而其余的4个基因（PB1、PA、M 和NS）则分别可编码2种或2种以上的病毒蛋白，说明流感病毒的一个基因并非总是编码一个蛋白。通过利用细胞的mRNA 剪接机制，流感病毒M 基因至少可以产生3种不同形式的病毒mRNA，其中mRNA4编码的M42蛋白是近年来新发现的又一个流感病毒蛋白，很有可能流感病毒基因组编码的某些蛋白至今仍未被发现。

由于细胞内mRNA 剪接形式及蛋白翻译机制的不同，仅仅依赖病毒基因组或mRNA 的信息仍不足以全面地了解流感病毒基因组所能编码的全部蛋白。今后有望通过病毒的蛋白质组学和转录组学等技术方法，发现更多的流感病毒相关基因节段所编码的新蛋白成员，这对深入了解和揭示流感病毒的蛋白组成、功能、病毒蛋白与细胞之间的相互作用，对病毒的诊断、抗病毒药物和疫苗的研发将具有重要的理论和实践意义。

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