水稻纹枯病菌拮抗菌CZB40的筛选、鉴定及其发酵条件优化

陈 丹，叶 波，刘燕娟，周鑫钰，雷湘华，段雍明，朱宏建＊

（1.湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128；2.植物病虫害生物学与防控湖南省重点实验室，长沙 410128；3.湖南省安乡县农业局，常德 415000）

水稻纹枯病是由立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）引起的导致水稻减产的重要病害［1］，一般可减产10%～30%，发病严重时可达50%。近年来，随着高产杂交稻品种的推广，施氮水平的提高，水稻复种指数的上升，纹枯病的发生日趋严重。目前我国水稻纹枯病的防治主要以井冈霉素为主，然而长期单一使用井冈霉素易导致R.solani产生抗药性［2］。而化学药剂的使用易带来农药残留、环境污染等问题，这些问题已引起国内外有关专家的高度关注。因此，加快新型农药品种研制和采用拮抗微生物来防治水稻纹枯病非常必要。

目前，国内外已报道了多种真菌、细菌和放线菌等微生物对水稻纹枯病具有不同程度防治效果［3-8］。Choi等［9］分离得到两株荧光假单孢杆菌（Pseudomonasfluorescens）mc75和pc78，两者互作能抑制纹枯病菌肽的生产和生物膜的形成。Wan等［10］报道，链霉菌（Streptomycesplatensis）F-1对水稻纹枯病有很好的抑制作用。Rabindran等［11］分离了4株对水稻纹枯病有抑制作用的荧光假单胞菌，其中PfALR2的防治效果最好。王兰英等［12］从砂仁中分离的4株内生细菌对水稻纹枯病有较好的抑菌活性，其中SRJ2-4抑菌效果最好，抑菌带宽度达到18mm，与其他菌株相比达极显著水平。朱晓飞等［13］分离筛选到对水稻纹枯病菌有强拮抗作用的解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）YB-3，具有广谱高效的植物病原菌拮抗活性。崔宇辉等［14］从采自浙江金华市各地的68份土样中分离筛选到吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）Sh-43对水稻纹枯病菌具有较强的拮抗作用，其抑菌带宽度为28.3mm。曹琦琦等［15］从不同土壤、植物和纹枯病菌菌核样品中分离筛选到对水稻纹枯病菌具有较强拮抗活性的细菌和放线菌菌株各1株，菌丝生长抑制率分别为75.56%和84.07%。

本试验从湖南省郴州市天鹅山风景区采集的土样中筛选出一株对水稻纹枯病菌有拮抗活性的放线菌CZB40菌株，能显著抑制纹枯病菌的菌核形成。结合形态、培养特征以及16SrDNA 序列对其进行了分类鉴定，另外对其发酵条件及发酵液的性质进行了研究，旨在为进一步防治水稻纹枯病提供生防材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土壤样品土壤样品采集于湖南省郴州市天鹅山风景区，于室温下风干，待分离。

1.1.2 供试菌株

本研究所涉及的病原菌均为本实验室分离、鉴定和保存，分别为水稻纹枯病菌（Rhizoctoniasolani）、草莓灰霉病菌（Botrytiscinerea）、稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）、辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsici）、辣椒白绢病菌（Sclerotiumrolfsii）、桃褐腐病菌（Moniliniafructicola）。

1.1.3 供试培养基及试剂

发酵初始培养基配方为：可溶性淀粉20g、蛋白胨3g、K2HPO40.5g、NaCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.5g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.2。拮抗试验培养基为马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。所用试剂均由长沙鹏润生物公司提供的市售生化试剂（分析纯）。

1.2 土壤放线菌的分离、保存

采用稀释涂布平板法［16］进行放线菌的分离。将采集的土壤稀释成不同浓度的土壤稀释液，分别滴加到含有3‰抑菌剂（K2Cr2O7）的高氏1号培养基平板上，用无菌涂布棒涂匀，静置30min后，将培养皿放在28 ℃温箱中倒置培养。采用画线法纯化菌株，所得菌株斜面保存，备用。

1.3 水稻纹枯病拮抗菌的筛选及测定

按照朱宏建等［17］的方法进行拮抗放线菌的筛选及测定。用细菌过滤器过滤发酵液。采用含毒介质法进行拮抗测定，每皿中加入菌株过滤液原液3mL，倒入12mL PDA 培养基（55℃左右）混匀，制成平板，待冷却后，每皿中央接种水稻纹枯病菌菌饼（直径5mm），设清水对照，每个处理重复3次。静置1h后放入28℃恒温箱中培养，待对照菌落长满整个平板，用十字交叉法测量菌落直径，记录结果并按下式计算抑制率：

1.4 拮抗菌株对纹枯病菌菌核形成及萌发的影响

将生长状况一致，直径为5 mm 的纹枯病菌菌饼置于经细菌过滤器过滤后的发酵液与PDA 混合的培养基上，置于28 ℃培养，记录菌核形成的时间及菌核数目。

拮抗菌株对纹枯病菌菌核萌发的影响按照郑爱萍等［18］的方法进行。将灭菌的载玻片浸入融化的PDA 琼脂中，使之附上一层琼脂，取出放在培养皿内，每皿1片，皿内加5mL无菌水保湿。选取大小、形成时间一致的菌核置于发酵菌液中（浓度稀释为108cfu／mL）处理10s，然后放在附有琼脂的载玻片上，每片3粒，粒距1.5cm，每处理8片24粒，置于28 ℃培养箱中培养，24h后镜检菌核的萌发情况。菌丝的萌发指数测定［19］：在玻片背面距菌核边缘2 mm 处画一圈，低倍镜下观察，以菌丝长出圈外者定为萌发菌丝。萌发菌丝按以下标准分级：0—萌发菌丝数为0；1—萌发菌丝数为1～20；2—萌发菌丝数为21～50；3—萌发菌丝数为51～80；4—萌发菌丝数为81～140；5—萌发菌丝数在140以上。再按以下公式计算菌丝萌发指数：

1.5 拮抗菌株CZB40的分类鉴定

1.5.1 拮抗菌株CZB40形态观察和生理生化特性

形态观察及生理生化测定方法均按照阮继生和Kauffmann 等［20-21］的方法进行。

1.5.2 拮抗菌株的分子生物学鉴定

1.5.2.1 放线菌株DNA 的提取与PCR 扩增

参照Kauffmann 等［22］及Nikodinovic等［23］的方法提取放线菌基因组DNA，并采用通用引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）和27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）进行PCR 扩增，PCR 反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30s，56 ℃复性30s，72 ℃延伸90s，33个循环；72 ℃延伸10min。用1.0%的琼脂糖凝胶对PCR 扩增产物进行电泳检测。采用北京天根生化科技有限公司的琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收目的片段，并采用该公司的pGM-T 克隆试剂盒进行PCR 扩增产物的连接以及连接产物的转化。挑选阳性克隆送上海生工生物工程技术有限公司测序。

1.5.2.2 系统发育分析

将测定的16SrDNA 序列提交到GenBank 数据库，用BLAST 软件与GenBank中已知的16SrDNA 序列进行同源性比较，选取属内同源性较高的放线菌16SrDNA 序列，用MEGA 4.0软件进行系统发育分析，绘制菌株的系统进化树［24］。

1.6 拮抗菌CZB40的抗菌谱测定

操作方法同1.3。

1.7 发酵条件的优化

1.7.1 碳、氮源的优化

采用单因子变量法，分别以大米粉、蔗糖、马铃薯淀粉、玉米粉、麦芽糖、葡萄糖代替对照培养基中的碳源（可溶性淀粉），进行碳源的优化；分别以酵母粉、硝酸钾、大豆粉、硝酸钠、硫酸铵代替对照培养基中的氮源（蛋白胨），进行氮源优化。刮取1.3中筛选到的菌株的孢子接入三角瓶（300 mL 容量）的100mL液体种子培养基中，28 ℃，200r／min振荡培养48h；液体种子以5%的接种量接入含100mL各种培养基中的三角瓶中（300 mL 容量），28 ℃，200r／min发酵培养72h。按照1.3中的方法，测定各个处理的抑菌效果。

1.7.2 均匀设计法优化发酵条件

用获得的最优碳、氮源代替对照培养基中的碳、氮源作为发酵培养基，并将碳源、氮源、NaCl、Mg-SO4、K2HPO4、pH、温度作为影响发酵条件的7 个因素，每个因素分别按一定浓度梯度设置5个水平，设计U20（57）的均匀设计表。按照1.3中的方法，将各个处理的发酵液稀释5倍，进行抑菌效果测定。

1.8 发酵液稳定性的测定

1.8.1 紫外照射稳定性测定

取CZB40菌株发酵液100mL置于无菌培养皿中，在距20 W 紫外灯10cm 处，分别照射1、3、5、7、9、12h，然后用含毒介质法测定其抑菌活性，并以未处理的发酵液为对照。

1.8.2 pH 稳定性测定

将菌株发酵液用1mol／L的NaOH 和1mol／L的HCl分别调至pH 为4、5、6、7、8、9、10，静置2h后将其分别调回自然pH（pH＝7.3），测定抑菌活性，并以未处理的发酵液为对照。

1.8.3 热稳定性测定

将等体积的菌株发酵液分别在50、60、70、80、90、100 ℃下处理1h，室温冷却，未经处理的发酵液作为对照，测定抑菌活性。

2 结果与分析

2.1 放线菌的分离筛选及拮抗活性测定

图1 菌株CZB40与水稻纹枯病菌对峙培养Fig.1 Strain CZB40confrontation culture with Rhizoctonia solani

从郴州市天鹅山自然风景区采集的18份土壤中筛选得到217个放线菌菌落，以水稻纹枯病菌为指示菌，筛选出5 株具有拮抗作用的菌株，其中以CZB40菌株的抑菌效果最好（图1），该菌株的5 倍无菌发酵滤液对指示菌的菌丝生长抑制效果也十分显著（图2）其抑制率高达90.45%。

图2 菌株CZB40对水稻纹枯病菌的抑制作用Fig.2 Inhibition of the strain CZB40 against Rhizoctonia solani

2.2 CZB40菌株对水稻纹枯菌菌核形成及萌发的影响

按1.4小节方法处理后，菌核的菌丝萌发指数降低了56.30%，菌核形成时间延长了36h，平均每皿形成的菌核数仅为2粒，而以清水为对照处理的每皿形成的菌核数为17粒（表1）。

表1 CZB40菌株对纹枯病菌菌核形成及萌发的影响（6次重复）1）Table 1 Effects of CZB40strain on sclerotium formation and germination against Rhizoctonia solani（6replicates）

2.3 放线菌CZB40菌株的分类鉴定

2.3.1 CZB40菌株的形态特征

CZB40菌株在高氏1号培养基上生长，菌落紧密，基内菌丝深红褐色，后期深橙色至红褐色，可溶色素褐黄色。气生菌丝很丰富，在扫描电镜下观察发现，气生菌丝体形成孢子链时，孢子丝直、柔曲，孢子呈长圆柱形，表面光滑（图3）。

2.3.2 CZB40菌株的分子生物学鉴定

PCR扩增及上海生工生物工程有限公司测序及拼接结果显示，CZB40菌株的16SrDNA 扩增产物的大小为1 474bp。将菌株的16SrDNA 序列提交至GenBank中（KJ751551），并用BLAST 软件与Gen-Bank中已公开的16SrDNA序列进行同源性比较，计算所测定的CZB40菌株的16SrDNA 全序列遗传距离，并根据遗传距离用MEGA 4.0软件构建系统发育树（图4）。结果表明，CZB40菌株与极暗黄链霉菌（S.fulvissimus）的16SrDNA序列相似性达到99%。

图3 放线菌CZB40菌株的孢子形态Fig.3 Morphology of the spores of strain CZB40

图4 菌株CZB40的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain CZB40

2.3.3 生理生化特性

CZB40菌株在高氏1号固体培养基中生长产生褐黄色色素。菌株能分解利用纤维素，使明胶液化，能水解淀粉，能产生硫化氢，能使牛奶胨化，但不能使牛奶凝固。根据生理生化特征分析，再结合形态学与培养特征及分子生物学鉴定结果，将其鉴定为极暗黄链霉菌（S.fulvissimus）。

2.4 菌株CZB40抗菌谱测定结果

抗菌谱测定结果表明，该菌株的发酵滤液对供试的多种植物病原菌均有抑制作用，菌丝生长抑制率为27.94%～85.71%（表2）。其中，对桃褐腐病菌的抑菌效果较好，抑制率达到85.71%。在5%和1%水平上显著高于其他几种病原菌。

2.5 发酵条件优化结果

2.5.1 不同碳、氮源对菌株发酵液抑菌活性的影响

在供试的6种碳源和5种氮源中，最优的碳源是玉米粉，对指示菌的生长抑制率为91.76%，最优的氮源是酵母粉，抑制率为92.50%（表3）。所以，选择玉米粉和酵母粉作为最优的碳源、氮源进行发酵条件研究。

表2 菌株CZB40对病原菌的抑制效果1）Table 2 Inhibition of strain CZB40against the fungal phytopathogens

表3 不同碳源、氮源对菌株CZB40发酵液抑菌活性的影响1）Table 3 Effects of different carbon and nitrogen sources on the antibacterial activity of fermentation broth of strain CZB40

2.5.2 均匀设计试验优化发酵条件

选择最优碳源（玉米粉）、最优氮源（酵母粉）、NaCl、MgSO4、K2HPO4、pH、温度为影响发酵条件的7个因素，每个因素设置5个水平，共20个处理，设计U20（57）的均匀设计表。将菌株CZB40按表中设计的20种发酵条件进行发酵，试验结果用DPS数据库处理系统进行分析和统计，得到各个发酵条件下的滤液对水稻纹枯病菌的抑制效果，在滤液稀释10倍时对菌丝生长抑制率最高达到94.85%，比优化前明显提高（表4）。从表中可知，该菌株的最优发酵条件是玉米粉25g／L、酵母粉5g／L、MgSO40.2g／L、NaCl 0.8g／L、K2HPO40.4g／L、水1 000mL、29℃、pH 6.0。

表4 均匀设计发酵条件优化结果1）Table 4 The results of uniform design optimization of fermentation conditions

对试验数据进行线性相关分析和逐步回归分析，本例拟合的线性回归方程和逐步回归方程经方差分析检验均无统计学意义（P＞0.05），因此做线性拟合不合理。再进行二次多项式逐步回归，结果如下：

模型统计学分析结果如下：方程的相关系数r＝0.915，F＝7.06，F0.05（8，11）＝2.95，F0.01（8，11）＝4.74，F＞F0.01（8，11）＞F0.05（8，11）。根据F检验，回归方程有统计学意义，其中P＝0.002 1（＜0.05），显著。按该数学模型得到的最佳培养条件是：玉米粉25g／L、酵母粉5g／L、NaCl 0.8g／L、MgSO40.2g／L、K2HPO40.4g／L、pH＝6、T＝29℃。各自变量偏回归系数的显著性检验结果见表5，菌株发酵液对水稻纹枯病菌抑制作用影响最大的变量从大到小依次是：X1X6＞X1X4＞X6X7＞X1X5＞X4X5＞X3X4＞X2X3＞X4X7。

表5 各自变量偏回归系数的显著性检验Table 5 Partial regression independent variables significance test of convergence

2.6 抑菌活性成分的特性分析

2.6.1 紫外稳定性

菌株发酵液距20 W 紫外灯10cm 照射1、3、5、7、9、12h后，与原发酵液相比较，对水稻纹枯病菌的抑制率变化不大，说明菌株CZB40发酵液对紫外线不敏感。

2.6.2 酸碱稳定性

放线菌菌株CZB40发酵液在酸性和碱性条件下比较敏感，稳定性差。分别用1mol／L 的HCl和1mol／L的NaOH 调原发酵液pH 至4.0和10.0，处理2h后，调回至原发酵液的pH，对水稻纹枯病菌的抑制率为53.80%和52.58%，与原发酵液90.45%相比，下降明显（图5）。因此在发酵液活性物质分离纯化和使用过程中应尽量保持pH 6～7的条件。

2.6.3 热稳定性

放线菌菌株CZB40 发酵液热稳定性较好。与原发酵液相比，在50 ℃以下处理1h后，抑制率没有变化。随着温度的升高，对水稻纹枯病菌的抑制率开始出现下降，在100 ℃处理1h后，抑制率为68.78%，与原发酵液90.45%相比，仅下降了21.67%（图6），说明菌株CZB40发酵液能耐高温。

图5 不同pH 对CZB40发酵液活性的影响Fig.5 Effects of different pH values on the activity of fermentation extracts of CZB40

图6 不同温度对CZB40发酵液活性的影响Fig.6 Effects of different temperatures on the activity of fermentation extracts of CZB40

3 讨论

目前研究者普遍认为：菌核在水稻纹枯病的传播中起重要作用，但目前报道的生防菌作用机制都是基于抑制病原菌菌丝生长为靶标的，抑制菌核形成的生防放线菌鲜有报道。郑爱萍等［18］曾报道过致黄假单胞菌对水稻纹枯病菌菌核形成具有明显抑制作用，并能使菌核的菌丝萌发率降低69.0%。张慧雯等［25］曾报道链霉菌702所产生的抗真菌活性物质，对水稻纹枯病菌的EC50为1.128 05mg／L，且对菌核萌发有较强的抑制作用。因此，筛选抑制纹枯病菌菌核形成及萌发的生防菌在生产上更有应用价值。本研究筛选到的生防放线菌菌株CZB40对纹枯病菌菌丝生长抑制率高达90.45%，并且能使菌核的菌丝萌发指数降低56.30%，显著抑制菌核的形成。

链霉菌产生的抗菌活性物质多为次级代谢产物，其生产效率不仅与菌种自身的性能相关，而且还要有最优的发酵条件。本研究对放线菌菌株CZB40需要的碳源、氮源进行了筛选，在此基础上对其发酵条件，如温度、pH、NaCl、MgSO4、K2HPO4等，进行均匀设计优化。另外对菌株CZB40发酵液性质进行了初步研究，这些研究结果为该菌株抗菌化合物的分离纯化、结构鉴定和拮抗机理的研究奠定了基础。

极暗黄链霉菌（S.fulvissimus）是一种能产生重要活性物质的放线菌，已经有大量研究人员对其代谢产物进行了报道。Malik 等［26］发现S.fulvissimus分泌抗菌蛋白，该蛋白表现出对金黄葡萄球菌（Staphylococcusaureus）MRSA 菌株有显著抑菌作用。它可能成为用于控制耐药性革兰氏阳性细菌新药物的重要来源。Ohbuchi等［27］报道S.fulvissimus产生溶解酶制剂，表现出N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和溶菌酶活性，可以迅速裂解细菌细胞。

本研究是国内首次报道使用极暗黄链霉菌（S.fulvissimus）拮抗水稻纹枯病菌。获得的菌株CZB40具有较高的杀菌活性和稳定性，可能是一种高效的新型生物农药的出发菌株，具有良好的开发前景，进一步的研究可从宏观方面对菌株CZB40发酵液中抗菌活性物质进行分离纯化、结构鉴定，并通过小区试验、田间试验检验其生防效果，进一步开发为生物农药；从微观方面可应用分子生物学手段研究其拮抗物质生物合成的功能基因及合成机理，并通过对野生菌株进行改良，使之符合生防要求。目前，本课题组已经开始分离纯化菌株CZB40发酵液中抗菌活性物质的主要成分。

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