砒霜酶解工艺研究*

张梦迪 王集会 高世杰△ 宋俊玉 郭 欣 姚鹏宇 刘方明

山东中医药大学药学院2011级制药工程 (济南250355)

砒霜酶解工艺研究*

张梦迪 王集会▲高世杰△▲宋俊玉 郭 欣 姚鹏宇□刘方明■

山东中医药大学药学院2011级制药工程 (济南250355)

目的:研究砒霜有效成分三氧化二砷(As2O3)的最佳酶解工艺。方法：本实验研究所用试剂为分析纯的As2O3，采用半仿生酶解法，按照进入消化系统顺序，先筛选出仿胃的最佳酶解工艺，在此基础上进行仿肠酶解。以酶底比、酶解时间和pH值为考察因素，设计正交试验，用二乙基二硫代氨基甲酸银法测定可溶解的相对砷离子含量，以砷转化率为指标，选择最佳酶解工艺。结果：仿胃以A2B1C2酶解后砷转化率最高，仿肠以A2B2C3酶解后砷转化率最高。结论：仿胃在pH<2.0的环境，酶底比为1，酶解时间为60 min的酶解工艺最佳，砷的转化率最高。仿肠在pH=7.5，酶底比为1.5，酶解时间为360 min时的酶解工艺最佳，砷转化率最高。

砒霜始载于《日华子本草》，由砒石升华而来，该药味辛、酸、大热、有大毒，归肝、胃经，《本草纲目》中记载砒石解毒治壅、烂肉，蚀瘀腐。现代临床与雄黄合用治疗化疗后感染类疾病[2]。作为一种传统的“以毒攻毒”药物，该药除应用于一些普通内外科病症外，还在恶性肿瘤的治疗方面显示出了良好的应用前景。但该药毒性较大，在有毒中药中金属元素砷的毒性，一直是广泛应用于临床的难题，科学研究中对药品中砷的含量也十分关注[3]。近年来砒霜在恶性肿瘤的治疗中显示出了良好的应用前景。砒霜主要成分是三氧化二砷(As2O3)，As2O3在治疗慢性粒细胞性白血病(CML)、急性粒细胞性白血病(ALP)、骨质增生异常综合征(MDS)等恶性血液系统疾病疗效显著，且对人胃癌移植瘤Flt-1、KDR和VEGFR-3表达有抑制作用[4，5]。但该药毒性较大，如何推广应用是临床的难题。本实验以分析纯As2O3为原料，用生物酶仿生提取的方法模拟人体内的消化过程，以pH值、酶底比、酶解时间为考察因素设计正交试验，用二乙基二硫代氨基甲酸银法测定酶解后溶解砷，以砷转化率为指标，确定了最佳酶解工艺。近年来临床中主要研究砷注射剂抗肝癌的作用，而砷口服制剂酶解工艺的研究较少。

1 仪器与试剂 FA1004N型电子分析天平(上海精密仪器有限公司)；SK-1快速混匀漩涡器(国华仪器)；KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；PHS-2C型实验室pH计(上海今迈仪器仪表公司)；LDZ4-0.8型离心机(北京医用离心机厂)；HWLC型电热恒温水温箱(北京医疗设备厂)；UV9100B型可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；仪表恒温水浴锅(黄骅市综合电器厂)

胃蛋白酶(批号：20120203，国药集团化学试剂有限公司)，胰蛋白酶(批号：20120529，国药集团化学试剂有限公司)，As2O3(分析纯)，浓盐酸(分析纯)，pH缓冲剂(邻苯二甲酸氢钾、混合磷酸盐)，锌粒(分析纯)，醋酸铅，三氯甲烷，酸性氯化锡试液、DCC银、碘化钾等均根据文献[1]配制。

2 方法与结果 2.1 砷标准曲线的绘制 精密量取标准砷溶液(10μg/mL)0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分别置于测砷装置的磨口锥形瓶中，加盐酸5 mL、水21 mL、碘化钾试液5 mL，最后滴加酸性氯化锡试液5滴，室温下放置10 min后，加无砷锌粒2 g，立即将导气管与磨口锥形瓶密塞，使生成的砷化氢气体导入平底玻璃管中。将磨口锥形瓶置于25 ℃～40 ℃水浴中反应45 min。取下平底玻璃管，添加三氯甲烷至5 mL刻度，混匀。将溶液移至1 cm比色皿中，用分光光度计在510 nm波长处以二乙基二硫代氨基甲酸银试液为空白对照，测定吸光度。以吸光度为纵坐标，标准砷溶液浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程为 y=0.1701x-0.0202。

2.2 设计正交试验选取最佳酶解工艺 以pH值、酶底比、酶解时间为因素，仿胃酶解调节不同的pH值(1.0,1.5,2.0)，加入不同量的胃蛋白酶(0.02g，0.03g，0.04 g)，并于37℃水浴中提取相应的的时间(30 min,60 min,90 min)。仿肠酶解调节不同pH值(6.5,7.5,8.5)后加入不同量的胰蛋白酶(0.025g，0.03g，0.035g)，并于37℃水浴中提取相应的时间(240 min,300 min,360 min)。

砷标准曲线图

2.3 超声提取 精密称取As2O30.02 g，加100 mL水溶解并称重，超声提取30min后称重并补足损失的水，再加100 mL水溶解并称重，超声提取30min后再次称重并补足损失的水。

2.4 仿胃提取 超声提取后，调节不同的pH值(1.0,1.5,2.0)，加入不同量的胃蛋白酶(0.02 g，0.03 g，0.04 g)，并于37℃水浴中提取相应的的时间(30 min,60 min,90 min)，然后经85℃水浴30 min杀酶。取适量于3000 rpm转速下离心10 min后，移取400 μL上清液，定容至10mL，用DCC银法测定该溶液中砷的含量。各因素离均差平方和计算公式SSj=(Ⅰj2+Ⅱj2+Ⅲj2)/9-C；Rj=Ⅰj2+Ⅱj2+Ⅲj2。方差分析表明,因素A对试验结果的影响非常显著，因素B也有显著影响，而因素C对试验结果没有显著影响。

由表1可见，试验方案为A2B1C2(pH值为2.0，酶底比为1，酶解时间为60 min)时，砷转化率最高。因此，选取砷的转化率最高的方案A2B1C2为最佳方案。酶解时间对试验没有显著性影响，pH值和酶底比对试验结果均有显著性影响。表1、2中的D列只是对误差的显著性分析，不作为因素。

2.5 仿肠提取 经最佳仿胃酶解工艺(pH值为2.0，酶底比为1，酶解时间为60min)提取后，调节不同pH值(6.5,7.5,8.5)后加入不同量的胰蛋白酶(0.025 g，0.03 g，0.035 g)，并于37 ℃水浴中提取相应的时间(240 min,300 min,360 min)，然后经85 ℃水浴30 min杀酶。取适量于3000 rpm转速下离心10 min后，移取400μL上清液，定容至10 mL，用DCC银法测定该溶液中砷的含量。方差分析表明,因素A和C对试验结果的影响非常显著，而因素B对试验结果没有显著影响。注:方差分析使用SPSS计算。

由表2可见，试验方案为A2B2C3(pH值为7.5的环境下，酶底比为1.5，酶解时间为360 min)时，砷转化率最高。因此，选取砷的转化率最高的方案A2B2C3为最佳方案,酶底比对试验结果没有显著性影响，pH值和酶解时间对试验结果有显著性影响。

根据仿胃显著性分析表明pH和酶底比有显著性影响，根据表1分析结果表明仿胃酶解最佳工艺为A2B1C2。即在pH值为2.0的环境下，酶底比为1，酶解时间为60 min的酶解工艺最佳，此酶解工艺的砷转化率最高。根据仿肠显著性分析表明pH值和酶解时间有显著性影响，根据表2分析结果表明仿肠酶解最佳工艺为A2B2C3。即在pH值为7.5、酶底比为1.5、酶解时间为360 min时的酶解工艺最佳，此时砷的转化率最高。

表1 仿胃酶解工艺正交试验结果

表2 仿肠酶解工艺正交试验结果

3 讨 论 采用半仿生的方法，因人体消化吸收顺序先经过胃的消化吸收再进入肠中，所以此实验先筛选出仿胃的最佳酶解工艺，以此为基础进行仿肠酶解。仿胃酶解在pH值为2.0的环境下，酶底比为1，酶解时间为60 min的酶解工艺最佳，此酶解工艺的砷转化率最高，仿肠酶解在pH值为7.5、酶底比为1.5、酶解时间为360 min时的酶解工艺最佳，此时砷的转化率最高可以为含As2O3口服药物的研究提供参考。因为As203在水中的溶解度很小，自然溶解耗时，超声提取有助溶的作用，经验证，超声提取1h可加速砷溶解于水，保证酶解的是未溶于水的As203。As203是两性物质，微溶于水，溶于酸碱，本次实验结果表明pH可影响As203的在水中的溶解度。本实验酶解研究用分析纯的As2O3代替砒霜，是以砷转化率为指标探究酶解最佳工艺的，若以药理活性为指标进行研究，会更具有临床意义，此工作有待于今后的进一步研究。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版，一部)[M].北京：中国医药科技出出社.2010，附录50:51.

[2] 朱文艳.复方雄黄膏治疗化疗肛周感染疗效观察[J].陕西中医,2011，32(8):1027-1030.

[3] 王新霞，宋雪玲.对中药龙齿重金属及砷盐限度规定的讨论.陕西中医,2012，33(2):233-236.

[4] 冉 伶，刘文君.三氧化二砷抗肿瘤作用机制研究进展.中国医药科学,2012，2(1):39

[5] 徐尔迪，肖延风.三氧化二砷对人胃癌裸鼠移植瘤Flt-1、KDR和VEGFR-3表达的影响.陕西医学杂志,2013，42(8):943-947.

(收稿2014- 09-02；修回2014-11-17)

Study on the process of Chinese medicine arsenic enzymolysis

2011 Levels of Pharmaceutical Engineering of Shandong University of Traditional Chinese Medicine(Jinan 250355)

Zhang Mengdi Wang Jihui Gao Shijie et al

Objective：To study the effective components of arsenic trioxidearsenic (As2O3) solution optimum enzyme. Methods:The experimental study of the reagents used for the analysis of pure As2O3, using semi bionic enzymatic method, according to the order into the digestive system, first screened the optimum enzyme hydrolysis process of imitation of the stomach, carried out on the basis of imitation intestinal enzyme solution. In the enzyme substrate ratio, enzymolysis time and PH value as factors,orthogonal experiment design, the determination of the relative content of arsenic ions dissolved with two ethyl two dithiocarbamate method with silver,arsenic transformation rate as an index, select the optimum hydrolysis process. Results: Imitation of stomach to A2B1C2 after enzymatic hydrolysis arsenic transformation rate is the highest, in imitation of the intestine to A2B2C3 after enzymatic hydrolysis of arsenic the highest conversion rate.Conclusion: imitation of stomach in pH < 2 environment, enzyme substrate ratio is 1, and the hydrolysis time of 60 min enzymolysis technology is the highest conversion rate of arsenic. In imitation of intestinal pH=7.5, enzyme substrate ratio is 1.5, the hydrolysis time is 360 min when the enzymolysis technology is best, the highest conversion rate of arsenic.

Arsenic @the enzymolysis technology

*山东中医药大学大学生训练(SRT)计划资助项目(2014172)

砒霜 @酶解工艺

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.04.047

△通讯作者

▲山东中医药大学实验中心化学实验室 (济南250355)

□山东中医药大学2012级中西医结合临床 (济南250355)

■北京刘方明国际医药研究院 (北京100083)