小型猪复合麻醉剂对大鼠中枢神经系统p-p38MAPK蛋白表达的影响

李 新，姜 胜，侯金龙，范宏刚，王洪斌

(东北农业大学 动物医学学院，哈尔滨 150030)

小型猪复合麻醉剂对大鼠中枢神经系统p-p38MAPK蛋白表达的影响

李 新，姜 胜，侯金龙，范宏刚，王洪斌*

(东北农业大学 动物医学学院，哈尔滨 150030)

为研究小型猪复合麻醉剂(XFM)对大鼠中枢神经系统p-p38蛋白表达的影响，将30只大鼠分为对照组(C组)和麻醉剂组(M组)，M组又分为4个亚组：M1组(注射XFM后大鼠翻正反射消失即刻)、M2组(注射XFM后大鼠翻正反射消失后1 h)、M3组(注射XFM后大鼠翻正反射恢复即刻)和M4组(注射XFM后大鼠翻正反射恢复后1 h)，各组大鼠到达预定的时间点后分别采取脑组织，应用RT-PCR法检测脑内p38 mRNA转录量，应用Western blot方法检测中枢神经系统中p-p38蛋白的表达量。大鼠注射XFM后，与对照组比较，试验组大鼠大脑皮层和丘脑p38 mRNA转录量显著降低(P<0.05)，在苏醒过程中有所恢复，但仍显著低于对照组(P<0.05)；大脑皮层和丘脑内p-p38蛋白的相对表达量，在M1、M2组的时间点显著低于对照组(P<0.05或P<0.01)；大鼠注射XFM后，与对照组比较，试验组大鼠小脑、海马、脑干内p38 mRNA转录量显著升高(P<0.05)，在苏醒过程中仍显著高于对照组(P<0.05)；小脑、海马、脑干内p-p38蛋白的表达量，在M1组、M2组、M3组显著升高，与对照组相比差异显著(P<0.05或P<0.01)，在M4组表达量下降，与对照组相比差异不显著(P>0.05)。结果表明，XFM诱导大鼠大脑皮层、丘脑内p38 mRNA及p-p38蛋白表达下调，p38 mRNA及磷酸化蛋白的改变可能是XFM作用的机制之一。

小型猪复合麻醉剂；中枢神经系统；p-p38蛋白；p38 mRNA

小型猪专用复合麻醉剂(XFM)对小型猪具有诱导迅速，麻醉维持时间适宜，苏醒平稳，麻醉效果确实，无明显副作用的特点[1-2]。但是其麻醉作用的相关机制有待进一步深入研究。近年来，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应途径与麻醉的关系逐渐成为众多学者研究麻醉与镇痛机制的热点，有研究报道全身麻醉剂与中枢神经系统中MAPK级联反应关系密切[3-4]，而且发现麻醉剂(如异氟醚、七氟醚和异丙酚等)能够影响p38MAPK信号转导通路[5-8]，由此推测p38MAPK信号转导通路可能与麻醉作用机制相关。本试验旨在通过研究XFM对大鼠中枢神经系统中MAPK级联反应途径中p-p38表达的影响，探讨p-p38与XFM麻醉的关系，为深入研究p38蛋白调控XFM麻醉机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小型猪复合麻醉剂(XFM)由东北农业大学外科教研室提供；一抗为兔抗p-p38(Tyr182)IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZS-101759)，小鼠抗β-action IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号TA-09)；二抗为辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZB-2301)，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZB-2305)；Blue PlusTMProtein Marker(14～100 ku)(北京全式金生物技术有限公司，目录号DM101)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型)(碧云天生物技术研究所，产品编号P0010S)，超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术研究所，货号P0018)，Western blot及IP细胞裂解液(碧云天生物技术研究所，货号P0013)；PVDF膜(0.45 μm)购自Sigma公司。Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix with东洋纺(上海)生物科技有限公司(货号FSQ-301)，LightCycler®Capillaries(20 μL)，美国 Roche 公司(货号 04929292001)；Epoch 酶标仪(美国BioTek公司)，蛋白电泳转印系统(美国Bio-Rad公司)；德国Sigma 3-30K高速低温离心机。

1.2 实验动物及分组

30只Wistar大鼠，雌雄兼有，体重210 g ±20 g，12～14周龄，购于吉林省长春市伊斯实验动物技术有限责任公司。随机选取6只作为对照组(C组)；其余24只大鼠作为麻醉剂组(M组)，M组又随机均分为4个亚组：M1组(注射XFM后大鼠翻正反射消失即刻)、M2组(注射XFM后大鼠翻正反射消失后1 h)、M3组(注射XFM后大鼠翻正反射恢复即刻)和M4组(注射XFM后大鼠翻正反射恢复后1 h)，每组6只。C组大鼠注射等量的生理盐水。大鼠置于安静的环境中饲养，自由采食和饮水，试验前12 h限饲不限水。

1.3 样品采集

各组大鼠到达预定的时间点后分别断头处死，取出全脑，用4 ℃生理盐水冲洗血迹，在生理盐水冰面上，用DEPC处理过的器械迅速分取大脑皮质、小脑、脑干、海马及丘脑。将采集的样品装入去RNA酶冻存管中，液氮速冻后，-80 ℃保存备用，分别用于p38 mRNA及p-p38蛋白含量的测定。

1.4 引物设计与合成

根据 GenBank 中公布大鼠p38(NM_017347.2)基因序列，大鼠β-actin(NM_031144.2)内参基因序列，使用Primer 5.0进行引物设计，委托生工生物工程(上海)有限公司合成引物(表1)。

表1 引物序列

1.5 样品检测

1.5.1 大脑组织总RNA提取及反转录 按照操作说明采用Trizol 法提取不同脑区总RNA，并用紫外分光光度计检测总RNA OD260 nm/280 nm比值，测得 RNA纯度和浓度；并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA的完整性。

根据反转录试剂盒说明书步骤，将提取的mRNA反转录成单链cDNA。反转录操作步骤为：Total RNA 0.5 pg～0.5 μg(本试验根据测得的RNA浓度将反转录的RNA量统一调整为 0.5 μg左右)，4×DN Master Mix(已添加gDNA Remover)2 μL，加Nuclease-free Water适量补齐总体积为8 μL，37 ℃ 水浴 5 min，加5×RT Master Mix II 2 μL，将反应液混匀后按以下温度进行反应：37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，98 ℃ 5 min，4 ℃ hold，将反应完成的cDNA 4 ℃保存备用。

1.5.2 荧光定量 PCR反应和标准曲线制备 PCR条件优化如下，反应体系为 SYBR®Premix Ex TaqTMII(2×)10 μL，上游引物(10 μmol·L-1)0.8 μL，下游引物(10 μmol·L-1)0.8 μL，cDNA 2 μL，ddH2O(灭菌)6.4 μL。β-actin与p38的反应条件：95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 5 s、57 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s共45个循环；熔解曲线分析：95 ℃ 0 s，20 ℃· s-1；65 ℃ 15 s，20 ℃· s-1；95 ℃ 0 s，0.1 ℃· s-1。对PCR产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，检测引物特异性。随机取1个cDNA样品，以10倍梯度倍比稀释5个梯度，以此作为标准品模板分别制作β-actin和p38的标准曲线，各样品均按上述条件检测，每个样品 3个重复，以均值计算结果。

1.5.3 脑内p38蛋白提取及蛋白质质量浓度测定 将样品称重后转移至玻璃匀浆器中，按照每10 mg组织加入70～120 μL裂解液的比例加入蛋白裂解液，在冰浴中充分匀浆研磨后将悬液转移至EP管中，4 ℃ 10 000 g离心5 min，取上清。采用BCA法测定样品中总蛋白质质量浓度。

本试验选择RIPA蛋白裂解液裂解方法提取组织蛋白质，采用BCA法检测蛋白质浓度，使用酶标仪在562 nm波长测定吸光度值，建立标准曲线，根据标准曲线计算样品蛋白质浓度。

1.5.4 蛋白质电泳与印迹 试验选择制备10%的分离胶和 5%的积层胶分离蛋白质。选择湿转法进行免疫印迹转膜，转膜条件为恒流300 mA转膜50 min。封闭转印PVDF膜选择5%的脱脂奶粉，室温摇床摇动封闭2 h。随后将膜转入一抗(β-actin的稀释比例为1∶500，p-p38的稀释比例为1∶400，一抗稀释液为5%的脱脂乳)4 ℃ 摇动孵育过夜。一抗孵育结束后，用TBST在室温下摇床上漂洗3次，每次5 min。随后二抗(羊抗兔二抗稀释比例为1∶3 000，羊抗小鼠二抗稀释比例为1∶4 000，二抗稀释液为TBST)室温孵育2 h，用TBST在室温下摇床上漂洗3次，每次15 min结束后使用ECL发光试剂盒检测目的蛋白，在暗室中显影，曝光，保存。

1.6 结果分析与数据处理

2 结 果

2.1 RNA纯度与完整性

将提取的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见 28S与18S RNA 条带清晰，无明显降解，每个样品测OD值均在1.8～2.0，提取的 RNA样品质量符合RT-PCR试验要求。

2.2 蛋白质免疫印迹

提取大鼠脑组织总蛋白质，测定浓度。各个时间点样品处理后，加适量样品缓冲液煮沸，进行电泳，转膜，后经一抗、二抗体孵育后，ECL发光，显影，曝光后的X光片结果见图1，结果显示，条带清晰，背景干扰小。

图1 各组大鼠在应用XFM后β-actin蛋白和p-p38蛋白的免疫印迹结果Fig.1 Result of β-actin protein and p-p38 protein Western blot

大鼠注射XFM后，与对照组比较，试验组大鼠大脑皮层p38 mRNA转录量(表2)显著降低(P<0.05)，在苏醒过程中有所恢复，但仍显著低于对照组(P<0.05)；大脑皮层p-p38蛋白的相对表达量(表3)，在翻正反射消失(M1组)、翻正反射消失后1 h(M2组)的时间点显著降低，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，翻正反射恢复(M3组)的时间点有所恢复，但没有恢复到正常水平，与对照组相比差异显著(P<0.05)，在翻正反射恢复后1 h(M4组)的时间点恢复到正常的水平，与对照组相比差异不显著(P>0.05)。

2.3 小型猪复合麻醉剂对大鼠脑内p38 mRNA及p38蛋白表达的影响

大鼠注射XFM后，与对照组比较，试验组大鼠小脑p38 mRNA转录量(表2)显著升高(P<0.05)，在苏醒过程中仍显著高于对照组(P<0.05)；小脑p-p38蛋白的表达量(表3)，在翻正反射消失(M1组)、翻正反射消失后1 h(M2组)、翻正反射恢复(M3组)的时间点显著升高，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，在翻正反射恢复后1 h(M4组)表达量下降，与对照组相比差异不显著(P>0.05)。

大鼠注射XFM后，与对照组比较，试验组大鼠海马p38 mRNA转录量(表2)显著升高(P<0.05)，在苏醒过程中仍显著高于对照组(P<0.05)；海马p-p38蛋白的表达量(表3)，在翻正反射消失(M1组)时间点和翻正反射消失后1 h(M2组)的时间点显著升高，与对照组相比差异显著(P<0.05)，在翻正反射恢复(M3组)的时间点显著升高，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，在翻正反射恢复后1 h(M4组)表达量下降，对照组相比差异不显著(P>0.05)。

大鼠注射XFM后，与对照组比较，试验组大鼠脑干p38 mRNA转录量(表2)在翻正反射消失后1 h(M2组)的时间点显著升高，与对照组相比差异显著(P<0.05)；脑干p-p38蛋白的表达量(表3)，在麻醉过程中至翻正反射恢复时显著高于对照组，差异显著(P<0.05或P<0.01)，在翻正反射恢复后1 h(M4组)恢复到正常水平，与对照组相比差异不显著(P>0.05)。

大鼠注射XFM后，与对照组比较，试验组大鼠丘脑内p38 mRNA转录量显著降低(P<0.05)，在苏醒过程中翻正反射恢复及恢复后1 h有所恢复，仍显著低于对照组(P<0.05)；丘脑内p-p38的表达量(表3)，在翻正反射消失(M1组)、翻正反射消失后1 h(M2组)、翻正反射恢复(M3组)和翻正反射恢复后1 h(M4组)的时间点表达量显著下降，与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

表2 XFM对大鼠不同脑区p38 mRNA转录量的影响

表3 XFM对大鼠不同脑区p-p38蛋白表达的影响

3 讨 论

p38MAPK信号转导通路在神经系统中发挥重要的作用，p38蛋白激酶是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的重要成员，参与细胞增殖、凋亡和分化等多种细胞生物学反应，已被证实在神经损伤导致的痛觉敏化的形成和维持中起着关键作用[9]，近年来研究还发现p38MAPK信号通路在长时程增强调控学习与记忆功能的作用机制中发挥重要作用[10]。

在本试验中，大鼠根据不同组别进行处理后，分别在不同的时间点采取大脑皮层、小脑、海马、脑干和丘脑，应用RT-PCR法检测脑内p38 mRNA转录量，应用Western blot方法检测p-p38蛋白的相对表达量，麻醉剂组试验结果显示注射小型猪复合麻醉剂后，在麻醉过程中大脑皮层和丘脑的p38 mRNA 和p-p38蛋白的相对表达量显著降低，而小脑、海马和脑干中p38 mRNA 和p-p38蛋白的相对表达量显著升高。结果提示XFM对大脑皮层和丘脑的p-p38蛋白的相对表达量有抑制作用，对小脑、海马和脑干的p-p38蛋白的相对表达量有促进作用。以往的研究表明，α2受体激动药右美托咪定能够抑制p38MAPK信号通路的激活，减少异氟醚所引起的神经元凋亡[11]，这与本试验中XFM抑制大脑皮层p-p38蛋白的含量的结果相近。吸入麻醉剂异氟醚能够提高海马脑区p38蛋白的含量而激活p38MAPK信号通路[12]，这与本试验中XFM激活海马脑区p-p38蛋白的含量的结果一致。本试验结果表明，注射XFM产生的麻醉作用与影响p-p38蛋白的相对表达量有关。

4 结 论

p38蛋白参与了小型猪复合麻醉剂(XFM)的麻醉过程。XFM能够抑制大脑皮层和丘脑p-p38蛋白的表达，提高小脑、海马和脑干p-p38蛋白的表达，这可能是其产生麻醉作用的机制之一。

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(编辑 白永平)

Effects of the Combined Anaesthetic for Miniature Pigs on the Expression of p-p38MAPK in Central Nervous System of Rats

LI Xin，JIANG Sheng，HOU Jin-long，FAN Hong-gang，WANG Hong-bin*

(VeterinaryMedicineCollege，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

In order to investigate the expression of p-p38 in central nervous system in rats anesthetized with the Combined Anaesthetic for Miniature Pigs (XFM)，30 rats were divided randomly into two groups：control group and XFM group.XFM group consisted of four subgroups：M1 subgroup (rats received XFM intraperitoneally and then waiting the disappearance of right reflection)；M2 subgroup (rats received XFM intraperitoneally and then waiting for 1 h after the disappearance of right reflection)；M3 subgroup (rats received XFM intraperitoneally and then waiting the recovery of right reflection) and M4 subgroup (rats received XFM intraperitoneally and then waiting for 1 h after the recovery of right reflection).The brain tissues were taken when reaching each time point.With the method of RT-PCR，expression of p38 mRNA were detected，and the expression of p-p38 in central nervous system was detected with Western blot.The results showed that，compared with the control group，the transcription ofp38 mRNA on cerebellum and thalamus in experiment groups were significant lower than that in control group (P<0.05)，andp38 mRNA increased at group M3 and group M4，but significantly lower than control group (P<0.05).In group M1 and group M2，the expression of p-p38 in cerebellum and thalamus were significantly lower than that in the control group (P<0.05)，but the expression of p-p38 in cerebellum，hippocampus，brainstem increased significantly after administration of XFM (P<0.05) in group M1，group M2，and group M3，compared with the control group，and in group M4，the expression of p-p38 decreased，were no difference with the control group (P>0.05).These results indicated that the decrease of the expression of p-p38 in cerebellum and thalamus were induced by XFM，and these changes ofp38 mRNA and p-p38 maybe one of the anaesthetic mechanisms of XFM.

XFM；central nervous system；p-p38；p38 mRNA

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.024

2014-11-10

国家自然科学基金项目(31272617；31472245)

李 新(1988-)，女，硕士生，主要从事动物麻醉与镇痛的研究，E-mail：747309128@qq.com

*通信作者：王洪斌，教授，博士生导师，E-mail：hbwang1940@163.com

S859.791

A

0366-6964(2015)07-1253-06