rfaE基因在副猪嗜血杆菌LOS刺激猪肺泡巨噬细胞炎性因子mRNA转录中的作用

曾 泽，岳 华，冯晓辉，何 欢，张 斌

(西南民族大学 生命科学与技术学院，成都610041)

rfaE基因在副猪嗜血杆菌LOS刺激猪肺泡巨噬细胞炎性因子mRNA转录中的作用

曾 泽，岳 华，冯晓辉，何 欢，张 斌*

(西南民族大学 生命科学与技术学院，成都610041)

为研究rfaE基因在副猪嗜血杆菌(HPS)脂寡糖(LOS)刺激猪肺泡巨噬细胞(PAMs)炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)mRNA转录中的作用，提取HPS SC096株及其rfaE基因缺失株(ΔrfaE)和互补株(cΔrfaE)的LOS，分别用5和10 μg HPS-LOS、ΔrfaE-LOS、cΔrfaE-LOS和E.coli-LPS刺激PAMs，分别在2、4、6、12和24 h后收集细胞，提取RNA并反转录成cDNA，运用RT-PCR检测IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA的转录水平。结果表明用5 μg HPS-LOS刺激细胞时，2、4、6、12和24 h后IL-1α mRNA的转录水平均升高，显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后的IL-1α mRNA转录水平(P<0.05)，12和24 h后IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的转录水平均升高，显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后的mRNA转录水平(P<0.05)，24 h后TNF-α mRNA的转录水平升高，显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后的mRNA转录水平(P<0.05)；10 μg HPS-LOS刺激细胞后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA的转录水平均升高，显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后的mRNA转录水平(P<0.05)。同时cΔrfaE-LOS刺激PAMs后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA的转录水平能够恢复到HPS-LPS水平。首次证实rfaE基因在HPS LOS刺激PAMs炎性因子mRNA转录水平中起着重要的作用。

副猪嗜血杆菌；rfaE基因；脂寡糖；炎性因子；mRNA转录水平

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)是猪上呼吸道的一种共栖菌，可以在特定的条件下侵入宿主体内引起以猪的纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征的全身性疾病[1-2]。在HPS中，脂寡糖(LOS)被证实参与HPS的致病过程，是一个重要的毒力因子，同时LOS还能刺激宿主细胞炎性因子的产生，但是哪些成分参与了这个过程还不清楚[3-5]。在革兰阴性菌中，rfaE基因编码的ADP-L-甘油-D-甘露庚糖参与核心多糖中L-甘油-D-甘露庚糖(HEP)的合成[6-7]。在HPS中，缺失rfaE基因导致细菌生长速度变慢，降低细菌抗血清杀菌作用和对细胞黏附入侵能力，同时还导致细菌LOS的糖链变短[8]。上述结果表明缺失rfaE基因后可能影响LOS核心多糖的合成，从而降低细菌的致病性。为了研究rfaE基因在 HPS LOS刺激猪肺泡巨噬细胞(PAMs)炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)mRNA转录中的作用，作者运用Real-Time PCR方法检测HPS-LOS、ΔrfaE-LOS和cΔrfaE-LOS刺激PAMs炎性因子的mRNA转录水平，以确定rfaE基因在HPS LOS刺激PAMs炎性因子转录水平中的作用。

1 材料与方法

1.1 菌种、细胞

所用HPS SC096菌株由本实验室分离保存，HPS的rfaE基因缺失株(ΔrfaE)及其互补株(cΔrfaE)由本实验室构建并保存[9]，PAMs购自ATCC公司。

1.2 主要试剂

TSA(胰蛋白胨大豆琼脂)、TSB(胰蛋白胨大豆肉汤)购自青岛海博试剂有限公司；新生牛血清购自郑州佰安生物工程有限公司；NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)购自北京博奥拓达科技有限公司，大肠杆菌(Escherichiacoli)O55：B5的LPS购自Sigma公司，RPMI 1640培养基和胎牛血清购自Gibco公司；PrimeScriptTMRT 试剂盒、SYBR premix Ex TaqTM、TaqDNA聚合酶、Trizol等购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 主要仪器

7300 Real-Time PCR System购自 Applied Biosystems公司；CO2培养箱购自Thermo公司；冷冻离心机购自Eppendorf公司。

1.4 LOS的提取及质量浓度的测定

将-80 ℃冻存的HPS SC096菌株及ΔrfaE和cΔrfaE在制备好的TSA(含新生牛血清和NAD)平板上复苏，37 ℃培养18～24 h。然后挑取单菌落在TSB(含新生牛血清和NAD)肉汤中于37 ℃、180 r·min-1振荡培养8～12 h。通过热酚法[9]提取LOS，采用蒽酮法[10]测定所提LOS的质量浓度。

1.5 猪肺泡巨噬细胞的培养及诱导

在12孔板上用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液37 ℃ 5% CO2培养PAMs。用5和10 μg不同剂量的HPS SC096菌株、ΔrfaE和cΔrfaE的LOS，E.coli的LPS刺激PAMs，同时设置空白对照，每种处理细胞的方法设置3个平行，在2、4、6、12和24 h后收集细胞。

1.6 总RNA的提取与反转录

加入Trizol收集PAMs，提取细胞总RNA，溶于20 μL DEPC处理水，用于合成cDNA。 利用PrimeScriptTMRT 试剂盒将RNA反转录成cDNA并置于-20 ℃待用。

1.7 Real-Time PCR

RT-PCR反应体系为20 μL：cDNA 2 μL，SYBR premix Ex TaqTM10 μL，引物F/R均为0.5 μL。反应条件：预变性95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 31 s；共进行40个循环，同时设定不加cDNA的阴性对照，检测IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA转录水平。由于用LPS刺激PAMs后核糖体蛋白L4(RPL4)的mRNA能够稳定表达，所以选取RPL4作为管家基因[11]。引物序列见表1，所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 炎性因子及管家基因引物序列

1.8 数据分析

参照K.J.Livak等[13]的介绍，不同组别中各炎性因子含量通过2-ΔΔCT法进行比较，所有数据用SPSS软件进行统计分析。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 提取的LOS质量浓度的测定

用葡萄糖标准品利用蒽酮法绘制标准曲线，测定所抽提的LOS质量浓度如下：HPS-LOS质量浓度为491.2 μg·mL-1，ΔrfaE-LOS质量浓度为452.1 μg·mL-1，cΔrfaE-LOS质量浓度为537.3 μg·mL-1。

2.2 RT-PCR检测LPS对PAMs 炎性因子的mRNA转录水平的影响

以E.coli-LPS为阳性对照，同时设置空白对照，用5和10 μg不同剂量的HPS-LOS、ΔrfaE-LOS和cΔrfaE-LOS刺激PAMs，用RT-PCR检测2、4、6、12和24 h后炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)的mRNA转录水平。

用5 μg 的HPS-LOS、ΔrfaE-LOS、cΔrfaE-LOS和E.coli-LPS刺激PAMs细胞2、4、6、12和24 h后对IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA转录水平进行相对定量分析，结果发现HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激细胞6、12和24 h后IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA转录水平明显升高(图1)，而且显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞12和24 h后IL-1β和IL-6的mRNA转录水平(P<0.05)，ΔrfaE-LOS刺激细胞12和24 h后IL-8的mRNA转录水平显著低于HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激细胞后IL-8的mRNA转录水平(P<0.001)，IL-1β，IL-8和TNF-α的mRNA转录水平在24 h后升高到最大分别为2.5倍，4.5倍和7.5倍。而IL-1α的mRNA转录水平在HPS-LOS，cΔrfaE-LOS刺激细胞2、4、6、12和24 h后都升高，而且显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后IL-1α的mRNA转录水平(P<0.05)，IL-1α的mRNA转录水平在24 h后升高到最大2.4倍。

*代表与野生型SC096的LOS刺激组相比差异显著(P<0.05)；**代表与野生型SC096的LOS刺激组相比差异极显著(P<0.001)。图2同* represent significant difference (P<0.05) when compared with the stimulated group of LOS from wild type SC096；** represent extremely significant difference (P<0.001) when compared with the stimulated group of LOS from wild type SC096.The same as below图1 5 μg LOS刺激PAMs 后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA转录水平的变化Fig.1 The mRNA transcription level change of IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α after 5 μg LOS stimulated PAMs

用10 μg的 HPS-LOS，ΔrfaE-LOS，cΔrfaE-LOS和E.coli-LPS刺激PAMs细胞2、4、6、12和24 h后对IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α mRNA转录水平进行相对定量分析，结果发现HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激细胞4、6、12和24 h后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α 的mRNA转录水平都有不同程度的升高(图2)，而且显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后mRNA转录水平(P<0.05)。用10 μg的 HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激细胞后IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA转录水平都显著高于5 μg的HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激细胞后的mRNA转录水平，但是用5 μg的 HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激细胞24 h后TNF-α的mRNA转录水平达到最高7.5倍，10 μg的 HPS-LOS和cΔrfaE-LOS刺激细胞12 h后TNF-α的mRNA转录水平达到最高却只有4.7倍。

3 讨 论

HPS是危害养猪业一个重要的细菌性病原，已造成巨大的经济损失[2]。在HPS中，LOS被证实是HPS中一个重要的毒力因子，参与了细菌的致病过程[3-5]。在革兰阴性菌中，用一定量的LOS刺激巨噬细胞时，LOS被Toll样受体4(TLR4)和伴侣分子MD-2识别，通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核转录因子(NF-κB)信号转导通路活化多种转录因子，从而合成并释放IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎性因子，再通过旁分泌或体循环作用于其他组织细胞，引起炎症反应[9，14-15]。PAMs能够分泌和释放多种炎性因子，并募集和趋化中性粒细胞等其他类型炎症性细胞到达肺泡间隙，在肺部急性炎症中发挥重要作用[16-17]。激活的PAMs能够产生一种内源性炎性因子TNF-α，它是一种具有广泛重要生物学作用的蛋白质，同时PAMs还能分泌IL-1，当IL-1的分泌量过高时可以刺激各种免疫细胞及炎性细胞产生TNF-α、IL-6和IL-8等多种炎性因子，从而介导炎性反应和细胞损伤。

图2 10 μg LOS刺激PAMs 后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA转录水平的变化Fig.2 The mRNA transcription level change of IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α after 10 μg LOS stimulated PAMs

在HPS中，外膜蛋白P2(OmpP2)和LOS均能刺激细胞释放IL-1α、IL-1β、IL-6和IL-8等炎性因子[4-5，12]。本试验利用提取的HPS-LOS、ΔrfaE-LOS和cΔrfaE-LOS来研究其刺激PAMs的炎性因子mRNA转录水平的变化，证实rfaE基因在LOS致病过程中的作用，研究结果表明HPS缺失掉rfaE基因后的LOS诱导炎症反应的能力明显降低。在鼠伤寒沙门菌、流感嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌和大肠杆菌中，缺失了rfaE基因均会导致LOS糖链的变短。本团队[8]进一步研究发现HPS缺失rfaE基因不仅导致细菌LOS的糖链变短，而且还导致了细菌生长速度变慢，降低了细菌抗血清杀菌作用和对细胞黏附入侵能力。rfaE基因编码的ADP-L-甘油-D-甘露庚糖参与了核心多糖中L-甘油-D-甘露庚糖(HEP)的合成，推断缺失了HPSrfaE基因核心多糖中L-甘油-D-甘露庚糖(HEP)的合成受阻导致了LOS糖链变短，这可能降低了LOS诱导炎症反应的能力。另外，IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子是重要的免疫调节因子，而ΔrfaE-LOS刺激细胞释放IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的能力明显降低，为HPS新型疫苗的研制开辟了新的途径。

4 结 论

ΔrfaE-LOS刺激猪肺泡巨噬细胞后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA转录水平明显降低，首次证实rfaE基因在HPS LOS诱导炎性因子mRNA转录水平中起着重要的作用，为研究rfaE基因在LOS诱导细胞致炎作用的分子机制奠定了基础。

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(编辑 白永平)

The Effect ofrfaEGene inHaemophilusparasuisLOS Induces Pro-inflammatory Cytokine mRNA Transcription in Porcine Alveolar Macrophages

ZENG Ze，YUE Hua，FENG Xiao-hui，HE Huan，ZHANG Bin*

(CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu610041，China)

The aim of this study was to study the role ofrfaEgene ofHaemophilusparasuislipooligosaccharide (LOS) which induced pro-inflammatory cytokine (interleukin (IL)-1α，IL-1β，IL-6，IL-8 and tumor necrosis factor (TNF)-α) mRNA transcription in porcine alveolar macrophages (PAMs).The LOS ofH.parasuisSC096 strain，rfaEmutant and its complementation was extracted.The PAMs were stimulated with LOS (5 μg and 10 μg) fromH.parasuisSC096，ΔrfaEmutant (ΔrfaE) and its complementation (cΔrfaE) and LPS fromEscherichiacolifor 2，4，6，12 and 24 h.The RNA was extracted and reversed into cDNA.The mRNA transcription of IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α were then detected by Real-time PCR.The result showed that the mRNA transcription of IL-1α in PAMs induced by 5 μg LOS fromH.parasuisfor 2，4，6，12 and 24 h were up-regulated，and significantly higher than the mRNA transcription of IL-1α in PAMs induced by 5 μg LOS from ΔrfaE(P<0.05)， the mRNA transcription of IL-1β，IL-6，IL-8 in PAMs induced by 5 μg LOS fromH.parasuisfor 12 and 24 h were up-regulated，and remarkably higher than the mRNA transcription of IL-1α in PAMs induced by 5 μg LOS from ΔrfaE(P<0.05)，the mRNA transcription of TNF-α in PAMs induced by 5 μg LOS fromH.parasuisfor 24 h was up-regulated，and notably higher than the mRNA transcription of IL-1α in PAMs induced by 5 μg LOS from ΔrfaE(P<0.05)；the 10 μg LOS fromH.parasuisup-regulated mRNA transcription of IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α in PAMs，and were significantly higher than that of 10 μg LOS from ΔrfaEmutant (P<0.05).At the same time，the cytokine mRNA transcription levels in PAMs induced by LOS fromcΔrfaEwere restored to the level in PAMs induced by LOS fromH.parasuis.The date firstly confirmed that therfaEgene were involved in the pro-inflammatory cytokine mRNA transcription in PAMs induced byH.parasuisLOS，suggesting that therfaEgene play an important role in the pathogenesis ofH.parasuisLOS.

Haemophilusparasuis；rfaEgene；lipooligosaccharide；pro-inflammatory cytokine；mRNA transcription level

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.07.021

2014-10-11

“十二五”国家高技术研究发展(863)计划 (2012AA101304)；国家自然科学基金(31302119)；四川省教育厅项目(14ZB046)；西南民族大学研究生创新型科研项目(CX2014SZ94)；公益性行业(农业)科研专项(201303034-1)

曾 泽(1991-)，女，贵州毕节人，硕士生，主要从事动物病原分子生物学研究，E-mail: 839017291@qq.com

*通信作者：张 斌，副研究员，E-mail: binovy@sina.com

S852.613

A

0366-6964(2015)07-1232-06