鞘氨醇单胞菌发酵生产韦兰胶的研究

董学前，刘元涛，王伟，张永刚，武琳，吉武科，刘建军

（1.山东省食品发酵工业研究设计院，山东 济南 250013；2.阜丰集团有限公司 山东 莒南 276600）

鞘氨醇单胞菌发酵生产韦兰胶的研究

董学前1，刘元涛2，王伟1，张永刚1，武琳1，吉武科1，刘建军1

（1.山东省食品发酵工业研究设计院，山东 济南 250013；2.阜丰集团有限公司 山东 莒南 276600）

韦兰胶（welan gum）是由鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas paucimobilis）分泌的一种可溶性胞外多糖。利用实验室优化筛选的一株韦兰胶产生菌Sphingomonas sp.511，通过单因素实验，研究了韦兰胶发酵工艺条件，得出韦兰胶适宜的发酵条件为：种龄15 h，接种量10%，装液量80mL（500 mL摇瓶），初始pH 8.0，摇床转速300 r/min，培养温度32℃，发酵时间72 h，在此实验基础上进行10 L发酵罐的放大试验，韦兰胶产率为25.76 g/L。

韦兰胶；鞘氨醇单胞菌；发酵工艺

韦兰胶（welan gum）是由鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）分泌的一种可溶性胞外多聚糖，其主链结构由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖重复单元构成，侧链由单一的L-吡喃鼠李糖基或L-吡喃甘露糖基构成［1-2］，此外约半数的主链重复单元含有乙酰基及甘油基团［3-4］，平均分子量在400～2 000 kDa之间［5］。韦兰胶溶液是一种典型的假塑性流体，与黄原胶相比，同等浓度下水溶液黏度高，特别是在低浓度下能保持较好的黏度；耐酸碱能力强，在pH 2～12范围内黏度几乎保持不变；温度对韦兰胶溶液的黏度影响较小［6-7］，0.4%的黄原胶溶液在135℃时黏度已趋于零，但同等条件下韦兰胶溶液在163℃时黏度才接近于零。另外韦兰胶具有很好的兼容性，例如，当其与黄原胶复配使用时，表现出很强的协同增稠作用，且耐盐、热可逆性质不受影响［8］。韦兰胶溶液受剪切后稀化，作为胶体流变特性优良，可作为增稠剂、黏合剂、乳化剂、稳定剂、悬浮剂、润滑剂和成膜剂被广泛应用，特别是在石油开采、混凝土、食品、医药等领域中具有较高的应用价值［9］。韦兰胶最早是由美国CP.Kelco公司研究开发［10］的一种新型微生物多糖，由于性能优良，近几年市场需求增长迅速，但国内韦兰胶生产领域还存在产率低，成本高，难以大规模推广应用的问题。开展韦兰胶的生产工艺研究有助于降低韦兰胶生产成本，提高经济效益。

近年来，韦兰胶在国内的研究逐步增多，但主要集中于实验室研究阶段，研究内容主要为菌种选育、摇瓶培养基优化、韦兰胶流变学性质及其影响因素等方面［11-15］，有关工业化生产的报道较少。本研究采用以Sphingomonas sp.ATCC31555为出发菌株筛选得到的韦兰胶高产菌株Sphingomonas sp.511为生产菌，进行韦兰胶发酵条件的优化，有效提高了韦兰胶发酵产率，并通过10 L发酵罐的验证，最终获得韦兰胶的高产发酵条件，为后续研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 菌种

菌株Sphingomonas sp.511是本实验室利用Sphingomonas sp.ATCC31555为出发菌株筛选优化的一株高产韦兰胶的鞘氨醇单胞菌。

1.2 基本培养基

斜面培养基（g/L）：葡萄糖10，牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，琼脂粉20，pH 7.0。

种子培养基（g/L）：蔗糖20，酵母膏1，K2HPO42，MgSO4·7H2O 0.1，pH 7.0。

初始发酵培养基（g/L）：葡萄糖30，豆粕粉4，K2HPO42，MgSO4·7H2O 0.3，pH 7.5。

1.3 主要仪器与试剂

全自动发酵罐10 L（上海百伦生物科技有限公司）；NDJ-1黏度计（上海天平仪器厂）；紫外分光光度计（上海美析仪器有限公司）；pH计（德国赛多利斯集团）；恒温培养摇床（上海知楚公司）。

1.4 方法

1.4.1 培养方法

种子培养：将保存菌种接到新鲜斜面培养基上活化，30℃恒温培养3 d。将活化的斜面种子刮取两环接入装有100 m L种子培养基的500 mL三角瓶中，摇床转速为300 r/min，温度为30℃，培养12～16 h。

摇瓶培养：将培养好的种子液按10%（V/V）的接种量接入装有100mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，摇床转速为300 r/min，温度为30℃，时间70～72 h。

1.4.2 菌种生长曲线的绘制

按照1.4.1中所述种子培养方法，每隔3 h取1 mL发酵液样品，适当稀释，在600 nm下测定OD值，绘制菌种生长曲线。

1.4.3 检测方法

生物量测定：取5 mL发酵液并适当稀释，置于已预先称重的干燥离心管中，8 000 r/min离心20 min，弃上清，用去离子水洗涤2次，105℃烘箱内烘至恒重，称量即可。

残糖测定：3，5-二硝基水杨酸（DNS）法。

韦兰胶含量测定：取一定体积的发酵液，加入2倍体积的95%乙醇，玻璃棒搅动至析出韦兰胶，过滤得粗品，再用95%乙醇洗涤一遍，过滤，烘干至恒重，电子天平称重。

发酵液黏度测定：使用NDJ-1黏度计，4号转子，60 r/min室温下测定。

2 结果与讨论

2.1 菌种培养液对发酵过程的影响

2.1.1 菌种培养液菌种生长曲线

菌种培养过程中每隔3 h取样，测定菌液中菌体浓度，得到菌种生长曲线如图1。

图1 种子生长曲线

由图1可知，种子在经过6 h的延滞期后达到对数生长期，24 h后种子进入生长稳定期。

2.2.2种龄及接种量的选择

一般接种发酵的最适种龄是微生物对数生长期的中后期，研究考察了培养12～24 h之间不同种龄的种子液对韦兰胶合成的影响，结果如图2所示。最适种龄为15 h，接种对数生长期后期（18～24 h）的种子液，发酵结果呈下降趋势，这可能是因为15 h后菌体开始产胶，种子液黏度上升，被胶体包裹的菌体再次转接后代谢活性受影响。接种量的大小一般取决于菌株在发酵液中的生长速度。控制接种量在1%～15%之间，考察其对韦兰胶合成的影响，结果如图3所示。接种量小于10%时，胶产量与接种量接近线性关系，接种量大于10%时韦兰胶产胶率保持在一定的水平且略有下降，因此选定10%的接种量为最佳。

图2 种龄对韦兰胶合成的影响

图3 接种量对韦兰胶合成的影响

2.2 溶氧对韦兰胶发酵过程的影响

在好氧发酵过程中，发酵液溶氧高低是影响发酵过程的一个重要因素，特别是高黏度发酵液，发酵液溶氧量往往是发酵进程的制约因素。本文通过控制装液量考察溶氧对韦兰胶合成的影响，将500 mL摇瓶的装液量控制在40～180 mL之间，结果如图4所示。装液量小于80 mL时，产胶率和发酵液黏度较高，随着装液量的增加，产量变化不大，而发酵液黏度下降明显，随着装液量的增加，氧的传递受到限制，影响了韦兰胶的生物合成。因此，选取80mL为最适装液量。

图4 装液量对韦兰胶合成的影响

2.3 发酵液初始pH对韦兰胶发酵过程的影响

将发酵液初始pH控制在6.0～9.0之间，结果如图5所示。发酵液的初始pH在6.0～8.0之间时，产胶率和发酵液黏度随pH的升高而增加；在pH高于8.0以后，产胶率和发酵液黏度值则随着pH的增加有所下降，因此，选择初始pH为8.0。

图5 发酵液初始pH对韦兰胶合成的影响

2.4 温度对韦兰胶发酵过程的影响

温度对于菌体的生长及代谢活性影响极为显著。将发酵温度分别控制在28～36℃范围内，考察温度对韦兰胶发酵过程的影响，结果如图6所示。该菌株在此温度范围内均能生长发酵，以32℃为最佳，产胶率和发酵液黏度最高。这一结果与以前普遍采用的30℃发酵有显著区别［14，16-17］，很可能是由于菌株间的差异导致。

2.5 10L发酵罐中韦兰胶分批发酵特征

采用优化后的发酵培养基和工艺条件，进行10 L发酵罐发酵实验，装液量7 L，通风比1∶1 vvm，发酵初期搅拌转速300 r/min，随着发酵的进行，黏度上升，适当增加搅拌转速。韦兰胶分批发酵过程曲线见图7。菌体生长有明显的延滞期，在6 h后进入对数生长期，韦兰胶的合成开始于12 h左右，底物开始快速消耗，符合产物合成与菌体生长部分偶联的特征［18］。发酵进入后期（48 h后），由于发酵液黏度高且基质浓度较低，消耗速率下降，韦兰胶合成速率显著变慢，在48 h之前产生的韦兰胶占合成总量的70%以上。韦兰胶含量在发酵72 h左右达到最高，最终产率为25.76 g/L。

图6 温度对韦兰胶合成的影响

图7 发酵罐中韦兰胶分批发酵过程曲线

3 总结

以实验室筛选优化的Sphingomonas sp.511作为韦兰胶生产菌株，优化了发酵生产韦兰胶的工艺，确定最佳发酵条件为：种龄15 h，接种量10%，装液量80 mL（500 mL摇瓶），初始pH 8.0，摇床转速300 r/min，培养温度32℃，发酵时间72 h。在上述实验基础上在10 L发酵罐中开展发酵实验，装液量7 L，通风比1∶1，发酵初期搅拌转速300 r/min，并在发酵过程通过增加搅拌转速提高溶氧，韦兰胶最终产率可达到25.76 g/L，比优化前显著提高，为后续中试放大研究奠定了基础。

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（责任编辑：朱小惠）

Study on fermentation of welan gum by Sphingomonas sp.

DONG Xueqian1，LIU Yuantao2，WANGWei1，ZHANG Yonggang1，WU Lin1，JIWuke1，LIU Jianjun1
(1.Key Laboratory of Food and Fermentation Engineering of Shandong Province，Jinan 250013，China；2.Fufeng Group Co.，Ltd.，Junan 276600，China)

Welan gum is a soluble exopolysaccharide produced by Sphingomonas sp.The fermentation conditionswere optimized by single-factor experiments using a welan gum producing strain Sphingomonas sp.511 screened in our laboratory.The optimal fermentation conditionswere as follows：inoculum age 15 h，inoculum volumn 10%(V/V)，medium volumetric ratio 16%(V/V)，initial pH value 8.0，rotate speed 300 r/min，culture temperature 32℃and fermentation period 72 h.The scale-up test was carried out under these conditions and the concentration of welan gum reached 25.76 g/L.

welan gum；Sphingomonas sp.；fermentation

TQ92

A

1674-2214(2015)04-0030-04

2015-06-19

董学前（1978—），男，山东惠民人，高级工程师，研究方向为微生物发酵工程，E-mail：dxqn@163.com.