鞘氨醇单胞菌发酵生产韦兰胶的研究

2015-03-20 07:06董学前刘元涛王伟张永刚武琳吉武科刘建军
发酵科技通讯 2015年4期
关键词:装液发酵罐发酵液

董学前,刘元涛,王伟,张永刚,武琳,吉武科,刘建军

(1.山东省食品发酵工业研究设计院,山东 济南 250013;2.阜丰集团有限公司 山东 莒南 276600)

鞘氨醇单胞菌发酵生产韦兰胶的研究

董学前1,刘元涛2,王伟1,张永刚1,武琳1,吉武科1,刘建军1

(1.山东省食品发酵工业研究设计院,山东 济南 250013;2.阜丰集团有限公司 山东 莒南 276600)

韦兰胶(welan gum)是由鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)分泌的一种可溶性胞外多糖。利用实验室优化筛选的一株韦兰胶产生菌Sphingomonas sp.511,通过单因素实验,研究了韦兰胶发酵工艺条件,得出韦兰胶适宜的发酵条件为:种龄15 h,接种量10%,装液量80mL(500 mL摇瓶),初始pH 8.0,摇床转速300 r/min,培养温度32℃,发酵时间72 h,在此实验基础上进行10 L发酵罐的放大试验,韦兰胶产率为25.76 g/L。

韦兰胶;鞘氨醇单胞菌;发酵工艺

韦兰胶(welan gum)是由鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)分泌的一种可溶性胞外多聚糖,其主链结构由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖和L-鼠李糖重复单元构成,侧链由单一的L-吡喃鼠李糖基或L-吡喃甘露糖基构成[1-2],此外约半数的主链重复单元含有乙酰基及甘油基团[3-4],平均分子量在400~2 000 kDa之间[5]。韦兰胶溶液是一种典型的假塑性流体,与黄原胶相比,同等浓度下水溶液黏度高,特别是在低浓度下能保持较好的黏度;耐酸碱能力强,在pH 2~12范围内黏度几乎保持不变;温度对韦兰胶溶液的黏度影响较小[6-7],0.4%的黄原胶溶液在135℃时黏度已趋于零,但同等条件下韦兰胶溶液在163℃时黏度才接近于零。另外韦兰胶具有很好的兼容性,例如,当其与黄原胶复配使用时,表现出很强的协同增稠作用,且耐盐、热可逆性质不受影响[8]。韦兰胶溶液受剪切后稀化,作为胶体流变特性优良,可作为增稠剂、黏合剂、乳化剂、稳定剂、悬浮剂、润滑剂和成膜剂被广泛应用,特别是在石油开采、混凝土、食品、医药等领域中具有较高的应用价值[9]。韦兰胶最早是由美国CP.Kelco公司研究开发[10]的一种新型微生物多糖,由于性能优良,近几年市场需求增长迅速,但国内韦兰胶生产领域还存在产率低,成本高,难以大规模推广应用的问题。开展韦兰胶的生产工艺研究有助于降低韦兰胶生产成本,提高经济效益。

近年来,韦兰胶在国内的研究逐步增多,但主要集中于实验室研究阶段,研究内容主要为菌种选育、摇瓶培养基优化、韦兰胶流变学性质及其影响因素等方面[11-15],有关工业化生产的报道较少。本研究采用以Sphingomonas sp.ATCC31555为出发菌株筛选得到的韦兰胶高产菌株Sphingomonas sp.511为生产菌,进行韦兰胶发酵条件的优化,有效提高了韦兰胶发酵产率,并通过10 L发酵罐的验证,最终获得韦兰胶的高产发酵条件,为后续研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 菌种

菌株Sphingomonas sp.511是本实验室利用Sphingomonas sp.ATCC31555为出发菌株筛选优化的一株高产韦兰胶的鞘氨醇单胞菌。

1.2 基本培养基

斜面培养基(g/L):葡萄糖10,牛肉膏3,蛋白胨10,NaCl 5,琼脂粉20,pH 7.0。

种子培养基(g/L):蔗糖20,酵母膏1,K2HPO42,MgSO4·7H2O 0.1,pH 7.0。

初始发酵培养基(g/L):葡萄糖30,豆粕粉4,K2HPO42,MgSO4·7H2O 0.3,pH 7.5。

1.3 主要仪器与试剂

全自动发酵罐10 L(上海百伦生物科技有限公司);NDJ-1黏度计(上海天平仪器厂);紫外分光光度计(上海美析仪器有限公司);pH计(德国赛多利斯集团);恒温培养摇床(上海知楚公司)。

1.4 方法

1.4.1 培养方法

种子培养:将保存菌种接到新鲜斜面培养基上活化,30℃恒温培养3 d。将活化的斜面种子刮取两环接入装有100 m L种子培养基的500 mL三角瓶中,摇床转速为300 r/min,温度为30℃,培养12~16 h。

摇瓶培养:将培养好的种子液按10%(V/V)的接种量接入装有100mL发酵培养基的500 mL三角瓶中,摇床转速为300 r/min,温度为30℃,时间70~72 h。

1.4.2 菌种生长曲线的绘制

按照1.4.1中所述种子培养方法,每隔3 h取1 mL发酵液样品,适当稀释,在600 nm下测定OD值,绘制菌种生长曲线。

1.4.3 检测方法

生物量测定:取5 mL发酵液并适当稀释,置于已预先称重的干燥离心管中,8 000 r/min离心20 min,弃上清,用去离子水洗涤2次,105℃烘箱内烘至恒重,称量即可。

残糖测定:3,5-二硝基水杨酸(DNS)法。

韦兰胶含量测定:取一定体积的发酵液,加入2倍体积的95%乙醇,玻璃棒搅动至析出韦兰胶,过滤得粗品,再用95%乙醇洗涤一遍,过滤,烘干至恒重,电子天平称重。

发酵液黏度测定:使用NDJ-1黏度计,4号转子,60 r/min室温下测定。

2 结果与讨论

2.1 菌种培养液对发酵过程的影响

2.1.1 菌种培养液菌种生长曲线

菌种培养过程中每隔3 h取样,测定菌液中菌体浓度,得到菌种生长曲线如图1。

图1 种子生长曲线

由图1可知,种子在经过6 h的延滞期后达到对数生长期,24 h后种子进入生长稳定期。

2.2.2种龄及接种量的选择

一般接种发酵的最适种龄是微生物对数生长期的中后期,研究考察了培养12~24 h之间不同种龄的种子液对韦兰胶合成的影响,结果如图2所示。最适种龄为15 h,接种对数生长期后期(18~24 h)的种子液,发酵结果呈下降趋势,这可能是因为15 h后菌体开始产胶,种子液黏度上升,被胶体包裹的菌体再次转接后代谢活性受影响。接种量的大小一般取决于菌株在发酵液中的生长速度。控制接种量在1%~15%之间,考察其对韦兰胶合成的影响,结果如图3所示。接种量小于10%时,胶产量与接种量接近线性关系,接种量大于10%时韦兰胶产胶率保持在一定的水平且略有下降,因此选定10%的接种量为最佳。

图2 种龄对韦兰胶合成的影响

图3 接种量对韦兰胶合成的影响

2.2 溶氧对韦兰胶发酵过程的影响

在好氧发酵过程中,发酵液溶氧高低是影响发酵过程的一个重要因素,特别是高黏度发酵液,发酵液溶氧量往往是发酵进程的制约因素。本文通过控制装液量考察溶氧对韦兰胶合成的影响,将500 mL摇瓶的装液量控制在40~180 mL之间,结果如图4所示。装液量小于80 mL时,产胶率和发酵液黏度较高,随着装液量的增加,产量变化不大,而发酵液黏度下降明显,随着装液量的增加,氧的传递受到限制,影响了韦兰胶的生物合成。因此,选取80mL为最适装液量。

图4 装液量对韦兰胶合成的影响

2.3 发酵液初始pH对韦兰胶发酵过程的影响

将发酵液初始pH控制在6.0~9.0之间,结果如图5所示。发酵液的初始pH在6.0~8.0之间时,产胶率和发酵液黏度随pH的升高而增加;在pH高于8.0以后,产胶率和发酵液黏度值则随着pH的增加有所下降,因此,选择初始pH为8.0。

图5 发酵液初始pH对韦兰胶合成的影响

2.4 温度对韦兰胶发酵过程的影响

温度对于菌体的生长及代谢活性影响极为显著。将发酵温度分别控制在28~36℃范围内,考察温度对韦兰胶发酵过程的影响,结果如图6所示。该菌株在此温度范围内均能生长发酵,以32℃为最佳,产胶率和发酵液黏度最高。这一结果与以前普遍采用的30℃发酵有显著区别[14,16-17],很可能是由于菌株间的差异导致。

2.5 10L发酵罐中韦兰胶分批发酵特征

采用优化后的发酵培养基和工艺条件,进行10 L发酵罐发酵实验,装液量7 L,通风比1∶1 vvm,发酵初期搅拌转速300 r/min,随着发酵的进行,黏度上升,适当增加搅拌转速。韦兰胶分批发酵过程曲线见图7。菌体生长有明显的延滞期,在6 h后进入对数生长期,韦兰胶的合成开始于12 h左右,底物开始快速消耗,符合产物合成与菌体生长部分偶联的特征[18]。发酵进入后期(48 h后),由于发酵液黏度高且基质浓度较低,消耗速率下降,韦兰胶合成速率显著变慢,在48 h之前产生的韦兰胶占合成总量的70%以上。韦兰胶含量在发酵72 h左右达到最高,最终产率为25.76 g/L。

图6 温度对韦兰胶合成的影响

图7 发酵罐中韦兰胶分批发酵过程曲线

3 总结

以实验室筛选优化的Sphingomonas sp.511作为韦兰胶生产菌株,优化了发酵生产韦兰胶的工艺,确定最佳发酵条件为:种龄15 h,接种量10%,装液量80 mL(500 mL摇瓶),初始pH 8.0,摇床转速300 r/min,培养温度32℃,发酵时间72 h。在上述实验基础上在10 L发酵罐中开展发酵实验,装液量7 L,通风比1∶1,发酵初期搅拌转速300 r/min,并在发酵过程通过增加搅拌转速提高溶氧,韦兰胶最终产率可达到25.76 g/L,比优化前显著提高,为后续中试放大研究奠定了基础。

[1]FIALHO A M,MOREIRA L M,GRANJA A T,et al.Occurrence,production,and applications of gellan:current state and perspectives[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2008,79(6):889-900.

[2]LIHui,XU Hong,XU Hao,et al.Enhanced welan gum production using a two-stage agitation speed control strategy in Alcaligense sp.CGMCC2428[J].Bioprocess and Biosystems Engineering,2011,34(1):95-102.

[3]KANG K S,VEEDER G T.Heteropolysaccharide S-130:US,4342866[P].1981-08-03.

[4]STANKOWSKI J D,ZELLER S G.Location of the O-acetyl group in welan by the reductive-cleavage method[J].Carbohydrate Research,1992,224:337-341.

[5]URBANI R,BRANT D A.Kelco microbial polysaccharides S-130(welan)and S-657 display similar dilute aqueous solution behavior[J].Carbohydrate Polymers,1989,12:379-384.

[6]TAKOM,KIRIAKIM.Rheological properties of welan gum in aqueousmedia[J].Agricultural and Biological Chemistry,1990,54(12):3079-3084.

[7]CAMPANAS,ANDRADE C,MILAS M,et al.Polyelectrolyte and rheological studies on the polysaccharide welan[J].International Journalof BiologicalMacromolecules,1990,12(6):379-384.

[8]郭建军,李建科,陈芳,等.黄原胶和韦兰胶混胶黏度的影响因素研究[J].食品科学,2007,28(10):96-99.

[9]ALLEN F L,BEST G H,LINDROTH T A.Welan gum in cement compositions:US,5004506[P].1991-04-04.

[10]JANSSON PE,WIDMALM G.Welan gum(S-130)contains repeating units with randomly distributed L-mannosyl and L-rhamnosyl terminal groups,as determined by FABMS[J].Carbohydrate Research,1994,256(2):327-330.

[11]郭朝江,乔红群,李莎,等.低能N+注入诱变选育威兰胶高产菌的研究[J].辐射研究与辐射工艺学报,2007,25(5):266-270.

[12]李莎.威兰胶发酵工艺优化及结构性能的研究[D].南京:南京工业大学,2005.

[13]陈芳,李建科,徐昶.新型微生物多糖——韦兰胶的流变特性影响因素研究[J].食品科学,2007,28(9):49-52.

[14]蒋芸.新型微生物多糖威伦胶的发酵工业研究[D].无锡:江南大学,2008.

[15]李莎,徐虹,姜岷.产碱杆菌NX-3胞外多糖的结构与性能[J].微生物学报,2005,32(6):37-41

[16]AIHongxia,LIU Min,YU Pingru,et al.Improved welan gum production by Alcaligenes sp.ATCC31555 from pretreated canemolasses[J].Carbohydrate Polymers,2015,129:35-43.

[17]李会,李莎,冯小海,等.Alcaligenes sp.NX-3产威兰胶的补料分批发酵工艺研究[J].食品与发酵工业,2009,35(1):1-4.

[18]李会,李莎,徐虹.Alcaligenes sp.CGMCC2428产威兰胶的分批发酵动力学模型[J].南京工业大学学报(自然科学版),2010,32(4):27-31.

(责任编辑:朱小惠)

Study on fermentation of welan gum by Sphingomonas sp.

DONG Xueqian1,LIU Yuantao2,WANGWei1,ZHANG Yonggang1,WU Lin1,JIWuke1,LIU Jianjun1
(1.Key Laboratory of Food and Fermentation Engineering of Shandong Province,Jinan 250013,China;2.Fufeng Group Co.,Ltd.,Junan 276600,China)

Welan gum is a soluble exopolysaccharide produced by Sphingomonas sp.The fermentation conditionswere optimized by single-factor experiments using a welan gum producing strain Sphingomonas sp.511 screened in our laboratory.The optimal fermentation conditionswere as follows:inoculum age 15 h,inoculum volumn 10%(V/V),medium volumetric ratio 16%(V/V),initial pH value 8.0,rotate speed 300 r/min,culture temperature 32℃and fermentation period 72 h.The scale-up test was carried out under these conditions and the concentration of welan gum reached 25.76 g/L.

welan gum;Sphingomonas sp.;fermentation

TQ92

A

1674-2214(2015)04-0030-04

2015-06-19

董学前(1978—),男,山东惠民人,高级工程师,研究方向为微生物发酵工程,E-mail:dxqn@163.com.

猜你喜欢
装液发酵罐发酵液
餐厨废水和固渣厌氧发酵试验研究
添加矿质元素对灵芝菌株G8液体培养产漆酶的影响*
发酵罐不锈钢换热盘管泄漏失效分析
连翘内生真菌的分离鉴定及其发酵液抑菌活性和HPLC测定
桑黄纤孔菌发酵液化学成分的研究
Technology optimization of Medicago sativa leaf protein separation with foam fractionation
利用计算流体力学技术分析啤酒发酵罐构型对温度和流动的影响
30L发酵罐培养枯草芽孢杆菌产高密度芽孢的研究
纤维堆囊菌产埃博霉素B的发酵条件优化
HPLC与LC-MS/MS测定蛹虫草发酵液中虫草素的方法比较