胰脂肪酶抑制剂产生菌的筛选和鉴定

朱，吴石金

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江 杭州 3 1 0 0 3 2）

胰脂肪酶抑制剂产生菌的筛选和鉴定

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江 杭州 3 1 0 0 3 2）

采用简单快速的改良筛选平板法对土壤来源的微生物进行初筛，选取显色圈有明显变化的菌株进行紫外-可见分光光度法复筛，最终筛选出一株胰脂肪酶抑制剂生产菌株z123。通过菌株的形态、生理生化特性、16S rDNA序列同源性分析及系统发育进化树鉴定，确定该菌株为枯草芽孢杆菌。研究结果表明，该菌株能够产生抑制胰脂肪酶的活性物质，其发酵产物对胰脂肪酶的抑制率为38.4%，值得进一步研究。

脂肪酶抑制剂；枯草芽孢杆菌；分离筛选

现今大多数肥胖者属于食物诱导肥胖。食物在小肠中消化吸收，通过全身各循环系统到达身体各个部位。通常，当能量摄入超过消耗时，就会导致体内脂肪大量堆积。如能减少体内能量的吸收便可有效控制体重。胰脂肪酶是由胰腺分泌并对人体内甘油三酯消化过程起关键作用的酶［1］，应用胰脂肪酶抑制剂可有效抑制肠道中胰脂肪酶对脂肪的分解，减少脂肪酸的生成，从而降低小肠黏膜对脂肪酸的吸收［2-3］。所以胰脂肪酶抑制剂是一种比较安全的新型减肥药，它不刺激神经系统，不进入血液循序，只通过抑制肠胃中食物的吸收，达到减肥效果。

脂肪酶抑制剂的主要来源有化学合成、天然植物提取、微生物代谢等。化学合成的有机磷化合物对脂肪酶有很强的抑制作用，但这类脂肪酶抑制剂主要用于研究脂肪酶抑制的机理［4-5］。目前对于脂肪酶抑制剂的研究以植物提取物方面为主，如：葡萄籽的提取物［6-7］、米胚芽的提取物［8-9］、荷叶生物碱［10-11］、刺五加中的三萜皂苷［12］等。目前用于治疗肥胖的脂肪酶抑制剂主要是微生物发酵产物，如瑞士罗氏（Roche）公司在链霉菌中提取到有效的脂肪酶抑制剂成分lipstatin，其四氢化产物Orlistat是市售伊宁曼、赛尼可等减肥药品的主要成分。

自然界中微生物种类繁多，大多微生物同时具有易分离、易培养、低耗高产等优点，已成为各种酶制剂、药物的来源之一。微生物发酵代谢产物的开发已对农业、精细化工、食品加工、制药和环境保护等产生了深远的影响，随着基因工程技术的不断发展，各种新型的微生物代谢产物还会不断得到开发［13］。本文拟通过建立能够简单快速筛选具有胰脂肪酶活性抑制成分的筛选模型，对土壤来源的微生物进行筛选，获得代谢产物中含有胰脂肪酶活性抑制成分的菌株，为后续脂肪酶抑制剂的应用研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

猪胰脂肪酶（购于sigma）；对硝基苯酚棕榈酸酯（购于Alfa Aesar）；维多利亚蓝（购于国药集团）；聚乙烯醇（购于国药集团）；橄榄油（购于国药集团）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器

双层全温恒温培养摇床；D-37520型台式高速冷冻离心机（德国ThermoFisher）；SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博迅医疗设备厂）；YXQ-LSS型全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅（上海博迅医疗设备厂）；GE-100型DNA水平电泳仪；Mastercycler型聚合酶反应仪（德国Eppendorf）；Gel Dac XR+型凝胶成像系统（美国BIO-RAD）；光学显微镜（日本尼康）；分光光度计（美普达仪器公司）；恒温水浴锅（万华实验仪器厂）。

1.3 培养基与培养条件

牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl 5，pH 7.0～7.2。

高氏一号培养基（g/L）：可溶性淀粉20，KNO31，NaCl 0.5，K2HPO40.5，MgSO40.5，FeSO40.01，pH 7.2～7.4。

发酵培养基（g/L）：麦芽浸粉10，蛋白胨5，NaCl 4，pH 7.0～7.2。

改良固体筛选平板：称取聚乙烯醇3 g，加入100 mL蒸馏水并加热溶解，过滤除去未溶解部分后滴定至pH 10.3，分别量取聚乙烯醇溶液30 mL和橄榄油10mL，并进行乳化，量取10mL乳化液加入90 mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L，pH 10.3）中，同时加入1 mL 1%的维多利亚蓝作为指示剂。立即混匀。

固体培养基添加琼脂20 g/L。分离平板在30℃培养箱中培养2 d，发酵培养基在30℃、180 r/min摇床中培养2 d。培养基均115℃灭菌30min。

1.4 方法

1.4.1 菌株分离培养

土壤样品采集自杭州周边山林。将采集的土壤样品以梯度稀释法稀释成土壤悬液，分别涂布于牛肉膏蛋白胨培养基和高氏一号培养基分离平板上，30℃培养3 d，挑取单菌落于新的分离平板上，30℃继续培养2 d。

1.4.2 胰脂肪酶抑制剂筛选模型

初筛：以橄榄油为底物，维多利亚蓝为指示剂的改良筛选平板法［14-16］进行初步筛选。

挑取单菌落于15mL玻璃试管内用发酵培养基培养2 d，离心取上清液，与胰脂肪酶酶液等比例混合，经改良筛选平板筛选。根据不同菌株代谢产物对胰脂肪酶的不同抑制效果，固体平板上会产生直径大小不同的蓝色水解圈。阴性对照样品为胰脂肪酶酶液与发酵培养基的上清液等比例混合液，对比阴性对照样品水解圈大小（抑制能力与水解圈大小呈负相关），筛选出具有产脂肪酶抑制剂的菌株。

复筛：利用分光光度计，以对硝基苯酚棕榈酸酯为底物，发酵液样品上清液与胰脂肪酶酶液等比例混合作为反应物，于波长410 nm下测定吸光度值。发酵液样品的胰脂肪酶抑制能力与吸光度变化呈负相关，胰脂肪酶抑制能力越强则吸光度变化越小［17-18］。

初筛复筛均以50μg/mL奥利司他为阳性对照样品。

1.5 胰脂肪酶抑制活性测定

胰脂肪酶酶活定义：在37℃条件下，以每分钟转化生产1μmol对硝基苯酚所需的酶量为一个活力单位（U）。

胰脂肪酶作用于Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中的对硝基苯酚棕榈酸酯，使之水解释放出对硝基苯酚，后者在410 nm光波下有最大吸收值，通过测定吸光值的变化率可知对硝基苯酚的生成量，从而计算出酶的活性单位。酶活力的计算：

ΔA/min：410 nm波长下的吸光值的变化率；VR：反应液的体积，mL；D：稀释倍数；E410：410 nm波长下对硝基苯酚的摩尔消光系数，18.3 L/(mol·cm)；VE：所加酶液体积，m L；C：蛋白的原始浓度，mg/ mL；L：光程。

胰脂肪酶抑制率公式：

C：胰脂肪酶抑制率（%）；A：表示酶标准活性（U）；

B：抑制作用下酶活性（U）。

1.6 菌种鉴定

1.6.1 菌株的生长形态、生理生化鉴定

将筛选到的产胰脂肪酶抑制剂的菌株z123接种于牛肉膏蛋白胨培养基中。观察菌落形态，利用显微镜观察菌体、芽孢形态以及芽孢着生部位，并对菌株z123进行生理生化鉴定［19-20］。

1.6.2 菌株16S rDNA基因扩增、测序

采用16S rDNA序列分析法对菌株进行鉴定［21］。用OMEGA公司的基因组提取试剂盒（E.Z. N.A.TM Bacterial DNA Kit）快速提取菌株基因组DNA。以基因组DNA为模板，以通用引物27F和1492R为引物进行16S rDNA序列DNA扩增。

通用引物序列具体为：F27：5＇-GAGTTTGATC CTGGCTCAG-3＇，1492R：5＇-AGAAAGGAGGTGAT CCAGCC-3＇

PCR扩增反应体系：96℃预变性5 min，95℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸90 s，30个循环，72℃延伸10 min。切胶回收，扩增产物交由GENEWIZ公司测序。

2 结果与分析

2.1 菌株的初筛和复筛

在杭州市郊区梅家坞一带采集土壤样品，采用胰脂肪酶抑制剂筛选模型筛选分离得到200余株菌株，再经分光光度计法检测菌株发酵上清液对胰脂肪酶的抑制活性，最后筛选确定4株胰脂肪酶抑制剂生产菌株进行后续研究。筛选结果见图1和表1。

图1 胰脂肪酶抑制剂产生菌的初筛结果

表1 胰脂肪酶抑制剂产生菌的复筛结果

表2 菌株胰脂肪酶抑制剂活性测定

2.2 菌株的胰脂肪酶抑制剂活性测定

菌株4具有较强的胰脂肪酶抑制活性，通过上述方法测定各菌株对胰脂肪酶的抑制率，见表2。表2中可以看出菌株4具有较强的胰脂肪酶抑制活性，抑制率达到38%，因此选取菌株4进行进一步研究，并命名菌株4为z123。

2.3 菌株z123的形态观察及生理生化特征

菌体在牛肉膏蛋白胨固体培养基中形态：菌苔边缘不规则，表面白色，变厚不透明，表面干燥，有褶皱，在菌落中或菌落周边培养基里形成褐色色素。革兰氏染色呈阳性。扫描电镜（负染）下菌体呈杆状，鞭毛侧身，周身有纤毛，芽孢着生部落中间偏一端，细胞形态照片如图2。菌株生理生化特征见表3。

(a)菌落形态

(b)革兰氏染色

(c)菌株z123的电镜扫描图

(d)芽孢染色图2菌株z123形态观察

表3 菌株z123生理生化代谢

2.4 菌株z123的分子生物学分析

16S rDNA区域序列同源性分析是一种常用的细菌分子鉴定方法。菌株的16S rDNA片段扩增后测序得到一个长为1 427 bp的序列，16S rDNA以及Marker的琼脂糖电泳见图3。将序列结果在NCBI中进行BLAST同源序列搜索，根据搜索结果，选取相似性较高的菌种的相关序列进行分析。利用MEGA 6.0软件中的Neighbor-Joining法对结果进行比对分析，构建系统发育树，如图4所示。分析结果表明，菌株z123与枯草芽孢杆菌遗传距离最近。因此初步鉴定z123为Bacillus subtilis（枯草芽孢杆菌）。

3 讨论

自然界中微生物种类繁多，其代谢产物大相径庭，而微生物往往具有易培养，生长快速等优点，是各种酶制剂、药物的理想生产者。本文从杭州梅家坞的土壤中分离出一株产胰脂肪酶抑制剂的菌株，其菌苔在培养基上呈不透明白色，边缘不规则，且有褶皱，并能够在其菌苔中或菌苔周边培养基内产生褐色色素。通过菌株的形态、生理生化以及分子方面的鉴定，初步鉴定菌株z123为枯草芽孢杆菌。初步研究表明，其发酵产物对胰脂肪酶有较强的抑制能力，抑制率达到38.4%。目前，进入商品化的脂肪酶抑制剂成分主要是Lipstatin的氢化物奥利司他，Lipstatin由毒三素链霉菌产生，其发酵效价可达911μg/m L［22］。此外，孙菲等筛选到对胰脂肪酶抑制率达61%的放线菌。而本文则从细菌代谢产物中获得，后续将进一步对菌株z123进行发酵工艺优化的研究，提高菌株产胰脂肪酶抑制剂活性成分的能力，并尝试从菌株的发酵产物中分离胰脂肪酶抑制剂活性成分，推测其将会是一种新型的胰脂肪酶抑制剂。

图3 菌株z123 16S rDNA琼脂糖凝胶电泳图N—Narker；1—扩增后的16S rDNA

图4 菌株z123系统发育树

［1］GARZA A L，MILAGRO F I，BOQUE N，etal.Natural inhibitors of pancreatic lipase as new players in obesity treatment［J］. PlantaMedica，2011，77(8)：773-785.

［2］MARRELLIM，LOIZZOM R，NICOLETTIM，etal.In vitro investigation of the potential health benefits ofwild Mediterranean dietary plants as anti-obesity agents withα-amylase and pancreatic lipase inhibitory activities［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2014，94(11)：2217-2224.

［3］HOSSAIN P，KAWAR B，NAHASM E.Obesity and diabetes in the developing world：a growing challenge［J］.New England Journal of Medicine，2007，356(3)：213-215.

［4］KOKOTOSG.Inhibition of digestive lipases by 2-oxo amide triacylglycerol analogues［J］.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic，2003，22(5-6)：255-269.

［5］ELLROTT T.Aktuelle medikamentöse Ansätze in der Adipositastherapie［J］.DMW-DeutscheMedizinischeWochenschrift，2000，125(9)：256-261.

［7］任秀娟，马海乐.葡萄籽提取物脂肪酶抑制活性筛选及抑制机理的研究［J］.食品工业科技，2009(6)：181-183.

［8］王燕飞，张晖，郭贯新.米胚芽中胰脂肪酶抑制剂的抑制机理研究［J］.食品科技，2004(6)：94-96.

［9］张晖，温怀宇，姚惠源.大米胚芽中脂肪酶抑制剂的研究［J］.粮油食品科技，2004，19(1)：9-11.

［10］朱晓青，吕敬慈，霍世欣，等.荷叶生物碱对胰脂肪酶的抑制作用［J］.上海大学学报（自然科学版），2007，13(1)：85-87.

［11］王玉霞，刘斌，姜艳艳.荷叶生物碱提取纯化工艺研究［J］.北京中医药大学学报，2013，36(9)：622-626.

［12］LIFang，LIWei，FU Hongwei，et al.Pancreatic lipase-inhibiting triterpenoid saponins from fruits of Acanthopanax senticosus［J］.Chemical and Pharmaceutical Bulletin，2007，55(7)：1087-1089.

［13］陈坚，堵国成，卫功元，等.微生物重要代谢产物——发酵生产与过程解析［M］.北京：化学工业出版社，2005.

［14］施巧琴，碱性脂肪酶的研究——I.菌株的分离和筛选［J］.微生物学通报，1981，8(3)：108-110.

［15］邬敏辰，孙崇荣，邬显章.平板扩散法粗略确定碱性脂肪酶的活性［J］.无锡轻工大学学报，2000，19(2)：168-172.

［16］刘兰，周培华，曾伟，等.脂肪酶抑制剂产生菌的筛选和鉴定［J］.食品与生物技术学报，2013.32(2)：219-223.

［17］孙菲，郑榕，杨煌建，等.胰脂肪酶抑制剂产生菌的筛选［J］.生物技术进展，2014，4(1)：40-43.

［18］姚朗，苏勇，蒋华良.96孔板比浊法胰脂肪酶抑制剂体外筛选模型的建立［C］.中国药学会学术年会.2004.

［19］JOHN G H，NOEL R K，HAS P，et al.Bergey's manual of determinative bacteriology［M］.9th ed.Baltimore：Williams and Wilkins Press，1994.

［20］东秀珠.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京：科学出版社，2001.

［21］冯兴，潘康成，张顺泉.一株益生芽孢杆菌PabO2的16S rDNA测序鉴定［J］.中国饲料，2008(17)：4-7.

［22］韩俊茹，陈锡永.Lipstatin高产菌株的筛选［J］.中国抗生素杂志，2007，32(8)：459-461.

（责任编辑：朱小惠）

Screening and identification of pancreatic lipase inhibitor-producing strain

ZHU Jun，WU Shijin
(College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China)

The soilmicrobes were preliminarily screened by a simple and modified rapid screening method.The strains with significant change in color ring were selected to conduct a secondary screening through UV-visible spectrograph and one strain z123 capable of producing pancreatic lipase inhibitor was finally obtained.It was identified as Bacillus subtilis based on morphology，physiological and biochemical characterization，16S rDNA sequence homology analysis and phylogenetic tree.The inhibition rate of the fermentation product reached 38.4%，which had great value for further study.

pancreatic lipase inhibitor；Bacillus subtilis；isolation and screening

TQ920.1

A

1674-2214(2015)04-0010-05

2015-04-16

浙江省自然科学基金资助项目（LQ14C170002，LY13B070008）

朱（1989—），女，浙江杭州人，硕士，研究方向为生物化学与分子生物学，E-mail：240038411@qq.com.通信作者：吴石金教授，E-mail：wujan28@zjut.edu.cn.