组织中RNA提取过程中影响因素的研究①

白 雪, 张丽颖, 刘莉娜, 李怀荆, 王艳秋, 纪汉庭, 孙艳男, 关宝生

(1.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007；2.绥化市第一医院检验科，黑龙江 绥化 152000)

组织中RNA提取过程中影响因素的研究①

白 雪1, 张丽颖1, 刘莉娜2, 李怀荆1, 王艳秋1, 纪汉庭1, 孙艳男1, 关宝生1

(1.佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007；2.绥化市第一医院检验科，黑龙江 绥化 152000)

在分子生物学的研究和应用中，组织RNA提取技术已经成为基本的实验技术，从组织中提取高质量的RNA是构建cDNA文库、研究基因表达和调控等的基础；在RNA提取实验中，RNA样品易受核糖核酸酶(RNase)的污染，该酶可以降解RNA；在实验中应严格控制各个影响因素，防止RNase的污染；笔者在阅读大量相关文献的基础上，根据自身实验经验，就组织中RNA提取过程中的影响因素总结如下。

RNA提取; 实验操作; 影响因素;RNase

RNA的提取技术是现代分子生物学中最常用的操作技术之一。不同组织中总RNA的提取实质上就是将组织细胞裂解，从而释放RNA，在进一步的研究中，我们高度依赖所提取的总RNA的质量[1]。RNA样品易受环境因素特别是RNase的影响而降解[2]，提取RNA的过程中，只要存在少量的RNase就会引起RNA降解。故在实验中应严格控制各个影响因素、防止RNase的污染，是提取高质量RNA样品的关键。

1 组织质量的影响

组织样本质量是RNA提取实验成功与否的重要因素之一。我们的实验是小鼠肿瘤组织总RNA的提取，基本所有组织和细胞都含有内源性RNase，为了防止总RNA的降解，使用液氮来速冻组织，在研磨组织的过程中，我们使用研钵加液氮研磨法进行研磨[3]。即研磨过程中将组织放入研钵后，加入液氮研磨并及时添加液氮，确保肿瘤组织能够一直浸在液氮中，防止RNA降解，保证RNA的质量。

2 实验器具的影响

由于RNA本身不稳定，加之RNase的普遍存在，使得分离完整的RNA分子更为困难[4]。在RNA提取过程中最主要是防止外源性RNase的污染，首先是要保证整个实验在超净工作台中完成；其次是对实验器具进行处理，主要有以下几点：(1)研磨过程使用的研钵需要高温干燥处理后使用；(2)实验中使用的EP管，枪头等塑料制品，需要用DEPC水[1]浸泡24h后，经高温灭菌干燥后使用；(3)为了防止RNase的污染，用DEPC水替代三蒸水进行溶液的配制；(4)RNA操作中使用专用的器械，有条件的也可以设置专用实验室。

3 实验人员的影响

实验人员对整个实验的影响，主要是外源性RNase的影响。外源性的RNase是无处不在的，它很容易污染实验中的各种器材、实验用品和实验试剂等；实际操作过程中，手套是最容易污染样品的，因此手套要勤换；实验操作人员说话过程中所带的唾液中也会携带RNase，会导致样品的降解，故需带口罩操作；在RNA整个提取过程中，实验人员熟练快速的完成整个RNA的提取，减少实验所用的时间，也可有效减少外源性RNase污染的几率。

4 实验试剂的影响

RNA提取的过程中，每一步所用试剂的量，以及所用的时间都会影响RNA的完整性、含量及纯度。

4.1 Trizol试剂

Trizol试剂是即用型细胞和组织总RNA提取试剂，可直接从组织或细胞中提取总RNA，能迅速裂解细胞，并抑制细胞释放出来的核酸酶；使用Trizol试剂时，1mLTrizol最多裂解100mg的组织，而在实际实验中，我们发现100mg的组织使用1.2mLTrizol裂解，可以获得更满意的结果。

4.2 氯仿

氯仿也叫三氯甲烷，是一种有机物-烃的衍生物，在光照下遇空气会逐渐被氧化并生成剧毒的光气，因此需要存放在密封的棕色瓶中；氯仿分离是RNA提取实验关键步骤之一，匀浆后的组织液中加入氯仿，震荡离心后，RNA会溶解在上层的水相中，转移RNA到新管的过程中，采用小枪头少量多次吸取，可防止误吸下层杂质[6]。

4.3 异丙醇和乙醇

RNA和某些杂质不溶于异丙醇，故异丙醇具有沉淀RNA的作用，RNA沉于管底后，用75%的乙醇对沉淀进行清洗，乙醇可洗去沉淀中可能的有机物杂质和残留的异丙醇。但由于醇类可以抑制核酸的反应，因此在弃乙醇后晾干的步骤是至关重要的，在这里不可以用加热或离心的方式使RNA干燥，否则会出现RNA样品很难溶解的现象。

5 RNA浓度的测定

在RNA提取之后，我们使用DU800紫外分光光度计测OD值来定量RNA的浓度。在测定OD值时，每一个样品测定前都需要用DEPC水进行仪器校正，测定后用蒸馏水彻底清洗比色杯，从而避免样品之间交叉污染，影响结果。

6 RNA的保存

由于RNase广泛存在，提取后的总RNA中常常会存在少量的RNase，随着保存时间的延长，极易出现RNA降解的情况；实验中一旦出现大量的RNA降解，会直接导致后续实验无法顺利进行。cDNA可反映RNA的性状，而且cDNA的稳定性较好。因此，提取后的RNA经过检测纯度和浓度合格后，应尽快进行后续实验或取部分RNA提取物及时逆转录成cDNA保存，以保证后续实验的顺利进行。

7 结语

RNA质量的好坏会直接影响后续实验，提取高质量RNA是后期实验的前提和基础。因此，熟练的掌握RNA提取的基本原理、注意事项和各种影响因素，对实验的成功与否至关重要。以上是笔者总结的一些经验，在实验过程中遇到具体的问题，还需要根据实际情况进行不断的改进和完善，从而使实验能够顺利完成。

[1]王桂玲, 黄东阳, 刘戈飞. 一种从动物组织中提取高质量总RNA的方法[J]. 生命科学研究, 2003, 7(3):275-278

[2]BarbasA,MatosRG,AmblarM,etal.NewinsightsintothemechanismofRNAdegradationbyribonucleaseII:identificationoftheresidueresponsibleforsettingtheRNaseIIendproduct[J] .JBioIChem, 2008, 283:13070-13076

[3]张宏山, 许明, 张阳, 等. 小鼠心肌组织3种总RNA提取方法比较[J]. 临床心血管病杂志, 2010, (2):149-150

[4](美)R.E.法雷尔.RNA分离与鉴定实验指南:RNA研究方法(原著第3版). 北京: 化学工业出版社, 2008, 26-27

[5]王长晔.RNA提取过程中DEPC的毒性[J]. 创新技术, 2008, (5):5-6

[6]戴先成, 柴智锋, 徐永城, 等.Trizol法大鼠心肌总RNA提取方法探讨[J]. 刑事技术, 2014,(3): 15-16

黑龙江省自然科学基金项目，编号：H201488；黑龙江省大学生创新创业训练计划项目，编号：201410222053；佳木斯大学青年基金项项目，编号：sq2012-37；佳木斯大学大学生科技创新项目，编号：XSYZ2014-004。

白雪(1982～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，讲师。

关宝生(1980～)男，黑龙江佳木斯人，在读博士研究生，助理研究员。E-mail：gbs@jmsu.edu.cn。

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