骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化的研究进展



骨髓间充质干细胞向软骨细胞定向分化的研究进展

何芒李宁夏磊

(郑州大学第一附属医院 骨科河南 郑州450052)

【关键词】骨髓间充质干细胞；培养分离方法；诱导分化方法；三维培养微环境

人体关节软骨的自身修复能力有限，目前关节软骨损伤后的临床治疗效果仍不够理想。软骨组织工程的提出为软骨损伤修复提供了新的选择，骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是成体干细胞中的一种，其来源充足，具有可再生能力和多向分化能力，也基本不存在免疫排斥和伦理学上的限制，是软骨组织工程的一种理想种子细胞。BMSCs向软骨定向诱导分化是一个复杂的过程，需要合适的培养分离方法、诱导分化方法、三维培养微环境，以及相关物理因素的刺激。这些因素一直是软骨组织工程研究的难点和热点，因此，本文对这些方面最近的研究进行总结。

1BMSCs的培养分离方法

BMSCs在骨髓中含量较低且体外培养难度大，通过体外分离培养得到纯度高、活性强且生物特性均一的BMSCs对软骨组织工程及其临床应用显得至关重要。

1.1全骨髓贴壁培养法利用造血细胞不贴壁而BMSCs贴壁的特点进行分离，随着换液和传代，在第3代能获得形态均一、高表达CD29、Scal-1且几乎不表达CD45的BMSCs细胞群[1]。实验通过全骨髓贴壁法培养兔BMSCs，通过换传代得到了纯度较高且具有活性的兔BMSCs[2]，王晓庆等[3]利用改良六孔板法培养出了大量贴壁活性的BMSCs，且比传统方法更便捷、高效。

1.2流式细胞仪免疫磁珠分离法Houlihan等[4]利用别藻蓝蛋白接合血小板源性生长因子受体-α抗体，异硫氰酸荧光素接合Sca-1抗体，藻红蛋白接合CD45抗体和Ter-119抗体与骨髓细胞过滤悬液培养后，经流式细胞仪去除死细胞和CD45+Ter-119+细胞系，得到了纯度较高、生物特性稳定的BMSCs。但此方法对实验室要求很高，且对细胞损伤大。另外，由于BMSCs在骨髓中的含量很低，每1×104～1×105个单核细胞中约有1个BMSC，每次分选均需要大量的小鼠骨髓。

1.3红细胞溶解法Peterbauer-Scherb等[5]通过比较3种分离小型猪BMSCs的方法(红细胞溶解法、右旋糖苷沉降法和密度梯度离心法)发现，红细胞溶解法是短时间内分离BMSCs最高效的方法，此方法可获得最高的细胞产率，为获得更纯化的BMSCs提供了新思路。

2诱导分化方法

目前骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导的方法较多，比较常见的诱导分化方法有两种，一种是生物化学诱导法，另一种是共培养法。

2.1生物化学诱导法生物化学诱导法主要是通过干预定向分化过程中的各种生物化学因子进行定向诱导分化。

2.1.1SOX家族研究发现，SOX9上游编码区包括多个成软骨分化增强子，其发生染色体畸变可导致短指发育不良等软骨发育障碍疾病[6]。Zhou等[7]通过抑制敲入纤维母细胞生长因子受体3基因的突变体细胞内SOX9的表达，从而加速了肥大前软骨细胞软骨内成骨的过程，提示SOX9是一个局限性区域高度流动性的转录因子，是BMSCs向软骨细胞定向分化的一个关键性的调节因子。

2.1.2miR29-bmiR29-b在BMSCs向软骨细胞的分化中具有正性调节作用[8]，可对同在细胞核内发挥作用的HDAC4进行调节[9]。HDAC4与Runx2结合后抑制Runx2和DNA的结合，从而正性调节软骨细胞肥大分化，但研究发现BMSCs经诱导生成的软骨细胞表现出肥大化表型后，会影响软骨细胞功能的稳定性，而发生细胞凋亡和基质钙化等现象，应用anti-miR-29b inhibitor使miR-29b受抑制后，可抑制软骨细胞肥大化过程，进而达到稳定细胞表型的目的[10]。

2.1.3TGF-βTGF-β是诱导BMSCs软骨分化的重要因子之一，刘印等[11]发现TGF-β1能全程诱导BMSCs向软骨细胞分化。TGF-β1诱导了BMSCs ColⅡ和ColⅩ基因的表达，而bFGF和PTHrP 抑制BMSCs在软骨分化过程中ColⅡ和ColⅩ基因表达，这两个细胞因子削弱了TGF-β1对BMSCs软骨诱导分化的作用，并抑制软骨化进程。研究发现联合表达BMP2和SOX9能促进体外MSCs成软骨分化[12]。

2.1.4PTHrP和IhhPTHrP是激素前体，绝大多数细胞能分泌PTHrP，细胞表面也存在1个或多个介导细胞旁分泌、自分泌、内分泌的PTHrP受体，其在软骨的形成发育过程中有相当重要的作用。实验发现，颞下颌关节盘前移位导致髁突软骨结构进行性病理性损害，Ihh和PTHrP在盘移位后髁突软骨病理性改变的过程中发挥重要作用，提示关节盘前移位可能通过Ihh-PTHrP负反馈信号通路对生长期髁突软骨内成骨过程产生影响[13]。Fischer等[14]研究显示，关节软骨细胞分泌的PTHrP能抑制共培养的BMSCs向肥大软骨细胞分化。

Ma等[15]发现Ihh是调节鸡软骨细胞增殖和肥大平衡的重要信号分子，并且调控Ihh依赖通路上PYHrP的功能，另外，BMP-6和Bcl-2阻碍Ihh信号通路的下游调节因子在维持软骨细胞增殖上发挥重要作用。

2.1.5FGF实验结果显示，在软骨细胞中硫酸酯酶在增强BMP的同时抑制FGF信号途径，从而保持稳定的软骨细胞内环境[16]。人类和鼠类高度保守性的FGFR3是酪氨酸激酶受体之一，在不同组织中可以表达，包括软骨组织，而敲除FGFR3等位基因的小鼠，其生存寿命变短，骨骼过度肥大[17]。

2.1.6IGFIGF在正常软骨中起维持软骨细胞代谢稳态的作用，保持着体外蛋白多糖合成和分解的平衡，是TGF-β1的重要辅助因子。研究显示，当归虫草多糖刺激IGF1和IGF1R基因过表达后，可以使黏多糖和尿苷二磷酸糖的生成增多，从而促进软骨低聚基质蛋白的表达，通过分泌软骨低聚基质蛋白连接骨基质中的纤维而促进软骨修复，这为关节软骨的治疗提供了一定的临床价值[18]。Pasold等[19]实验证实，在加入硅纳米颗粒接合IGF的胶原骨架培养基中培养软骨细胞能明显减少Ⅰ型胶原含量，增加Ⅱ型胶原的含量，提示其在靶向和可控治疗软骨损伤方面具有一定临床意义。Yang等[20]发现TGF-β1可能通过抑制Smad3磷酸化从而抑制纤维囊的形成，使生长的软骨细胞结构更加均匀，另外在流体力学的刺激下TGF-β1能够互反地对Smad2和Smad3通路进行调控，经过短暂的TGF-β1暴露可以促进软骨内环境的稳定，为软骨的修复打下基础。

2.1.7雌激素雌激素受体存在于软骨细胞表面。软骨细胞表面的雌激素受体主要分为α和β 2种，其中α受体主要分布在人类关节和生长板软骨中，β受体则主要位于生长板中的肥大细胞中。雌激素通过软骨细胞表面的雌激素受体起作用，与软骨正常代谢与修复有密切的关系。一项体外牛软骨移植研究显示[21]，雌激素影响TGF-β2、TGF-β3和软骨细胞的标志基因之一Ⅱ型胶原α1的表达，进而影响软骨细胞的分化与形成。

2.1.8炎性因子炎性因子对BMSCs向软骨细胞定向分化也有重要的影响，与关节软骨的功能抑制作用密切相关。其中，白介素-1和肿瘤坏死因子的影响最为重要，白介素-1可促进一氧化氮合酶和环氧化酶-2的表达，抑制软骨细胞表达蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，并促进细胞分解代谢[22]。Murray等[23]指出，人软骨细胞的异常形态学与白介素-1β的水平增高和细胞外Ⅳ型胶原的断裂有关。

2.2共培养诱导法共培养诱导法指在体外模拟体内BMSCs与软骨细胞相互作用的内环境，达到使BMSCs增殖和定向分化的目的。

2.2.1直接接触共培养法研究发现将无标记的软骨细胞与荧光标记的骨髓间充质干细胞以1∶2的比例混合均匀，进行共培养后应用荧光标记结合流式细胞术和共聚焦技术对直接接触共培养体系中的细胞分析后发现在直接接触共培养体系中骨髓间充质干细胞有明显的成软骨分化现象，但其比例逐渐减少，7 d后体系中软骨细胞成为主导细胞类型[24]。

2.2.2Transwell共培养法Transwell共培养是运用一种特殊的共培养工具进行细胞共培养，其共培养的两部分之间有一聚碳酸酯通透膜，这层膜带有微孔，孔径大小为0.1～12.0 μm，从而实现非接触性共培养。王万宗等[25]发现将BMSCs与关节软骨细胞在膜孔径为0.4 μm的Transwell共培养系统中共培养诱导20 d，经共培养诱导后检查发现，BMSCs被诱导成软骨样细胞。

2.2.3微囊体系培养法微囊是利用天然的或者合成的材料经过静电黏附、沉淀等工艺合成的一类囊状物，目前应用最为成熟的微囊是海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊，张瑾等[26]利用APA微囊发生器制得微囊化软骨细胞，并将其接种于培养BMSCs 12 h后的Transwell小室中进行共培养，在不影响BMSCs纯度和增殖的情况下成功诱导BMSCs向成软骨方向定向分化，且诱导效果优于传统的Transwell膜分离共培养法。

3三维培养微环境

三维培养环境是软骨组织工程中至关重要的一部分，它可以有效地促进干细胞的增殖和分化，同时也能够在新的组织形成前承载机械应力，在软骨组织工程中理想的三维培养支架应该具有良好的生物相容性、一定机械柔韧度、多孔可渗透而且可在体内生物降解，虽然合成材料在控制机械应力、形态学及物理化学因素方面具有一定优势，但这些材料常常引起体内的炎症反应，近年来广泛使用的是一些非合成材料，如丝心蛋白、胶原、明胶、硫酸软骨素、透明质酸等。

3.1Ⅱ型胶原支架有研究表明以Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)为细胞外支架材料与干细胞联合移植可促进其向软骨细胞方向分化[27]，由软骨细胞分泌合成的CollagenⅡ为软骨细胞的生存提供了良好的条件，有实验证实100 μg/ml的CollagenⅡ通过与之相关的受体正反馈调控了SOX9蛋白的表达，引起一系列诱导BMSCs向软骨细胞分化的信号转导机制，促进BMSCs向软骨细胞的分化[28]。

3.2三维SF-GCH支架Sawatjui等[29]发现经过冷冻干燥法制备的三维丝心蛋白/明胶-硫酸软骨素-透明质酸(SF-GCH)支架能够有效地促进BMSCs的自身增殖并且促进其向软骨细胞定向分化，此种支架中的GCH可以通过与生长因子相互作用而提供与增值分化有关的信号分子，从而促进MSCs的增值分化，显示SF-GCH混合支架可以作为软骨组织工程中促进和维持MSCs定向分化的一种新的生物材料。

4相关物理因素刺激

4.1基底材料表面粗糙度基底材料表面的粗糙度是影响细胞行为的重要因素，通过调节材料表面的粗糙度，可以调控细胞在材料表面的生长行为[30-31]。有研究发现以柞蚕丝胶(AS)溶液为模板，诱导羟基磷灰石(HAp)晶体的生成，可达到调控AS 膜表面粗糙度的目的，具有一定粗糙表面的HAp/AS 复合膜有利于BMSCs的黏附和增殖，且具有良好的生物相容性，粗糙度为1.2 μm的HAp/AS复合膜能显著促进BMSCs的增殖，并促进其在初期培养时的黏附，为BMSCs的贴壁培养提供了一种新的实验依据[32]。

4.2机械应力刺激黄艳等[33]指出机械刺激，如劳损、切应力、压应力、重力等对BMSCs的增殖、细胞骨架与分化均有影响，周围环境的机械刺激能通过各种信号途径调节BMSCs的生物学行为，这方面的研究将促进BMSCs向软骨分化的全面理解和有效利用。文献报道通过利用原子力显微镜和激光共聚焦显微镜对体外培养的大鼠MSCs细胞骨架进行高分辨成像，同时使用带有微球的微悬臂实施微区力曲线检测后发现细胞的弹性模量随应力刺激时间增长而增大，为通过控制应力刺激时间调节BMSCs分化的可能性提供了依据[34]。

5展望

目前应用BMSCs软骨诱导分化修复软骨缺损的方法已取得一定进展，但调控BMSCs向软骨细胞定向分化的各种因素是极其复杂的，在此过程中，促进定向分化因素与抑制定向分化因素保持着动态平衡，了解这一动态平衡的变化规律，并明确其机制，才能获得一种理想的培养BMSCs向软骨定向分化的方法。这将为软骨细胞工程与组织工程的研究提供指导性的意义，同时，也为临床上治疗软骨损伤提供更多的依据与保障。因此，研究BMSCs向软骨细胞的定向分化并将其更好地应用于临床，是当今应对软骨损伤的一大趋势，也是软骨组织工程未来研究发展的方向。

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收稿日期：(2015-07-20)

【中图分类号】R 394.2doi: 10.3969/j.issn.1004-437X.2015.12.029

通讯作者：夏磊，E-mail：2826292062@qq.com。